Mapeamento da variabilidade genética espontânea das cepas vacinais B19 E RB51 contra Brucella abortus, comercializadas no Brasil.

A brucelose é uma zoonose causada por bactérias intracelulares do gênero Brucella, que infectam humanos, animais domésticos e silvestres. Esta doença apresenta grande impacto econômico, devido à ocorrência de distúrbios reprodutivos nos animais. A prevenção contra infecções causadas por Brucella abortus em bovinos é feita por meio da administração das cepas vacinais B19 e RB51 de B. abortus. Existem relatos de que estas vacinas podem causar aborto às fêmeas vacinadas. Devido a isso, a vacinação de fêmeas jovens é preconizada. Entretanto, há diversos relatos na literatura de persistência da B19 no úbere, proporcionando a eliminação da bactéria pelo leite. Portanto, toda a ocorrência de aborto em animais vacinados, seja por B19 ou por RB51, merece um estudo aprofundado sobre a sua causa. Técnicas moleculares capazes de diferenciar cepas vacinais de cepas selvagens têm sido descritas. O gene ery, ligado ao catabolismo do eritritol, foi caracterizado como um importante marcador nessa diferenciação, por apresentar uma deleção espontânea de 702 pares de base na cepa B19. Como esta cepa é comercializada por diferentes empresas, estudos descreveram que algumas destas cepas comercializadas na Índia não apresentam essa deleção. No Brasil, não há registro sobre a origem das amostras B19 e RB51 utilizadas na confecção das vacinas comerciais, logo um estudo no sentido da verificação de possíveis mutações em relação à amostra padrão se faz necessário, devido a estas poderem reverter a sua virulência. Objetiva-se com este estudo caracterizar genotipicamente as cepas vacinais B19 e RB51 comercializadas no Brasil contra a brucelose bovina. A metodologia utilizada será a genotipagem de genes marcadores de virulência destas cepas vacinais, através da amplificação, sequenciamento e análises in silico das sequências obtidas. Os resultados obtidos permitirão a identificação do genótipo de todas as vacinas comerciais B19 e RB51 utilizadas para a imunização de bovinos no Brasil

INDEL de 12 e 23 pares de bases no gene da PRÍON bovina na raça Caracu.

A Encefalopatia Espongiforme Bovina (EEB) é uma zoonose que faz parte do grupo das Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (EETs). O agente etiológico é denominado de príon scrapie (PrPSc), que é uma proteína anormal. A proteína normal é a príon celular (PrPC), sintetizada a partir do gene prnp. Uma das mudanças que ocorrem no gene prnp em bovinos é a inserção e/ou deleção (indel) de sequências de bases, que podem ter um impacto sobre a formação da príon e, portanto, sobre a suscetibilidade ou resistência à EEB. Neste estudo, objetivou-se genotipar a variabilidade de nucleotídeos de 12 e 23 pares de bases (pb) indel em regiões específicas do íntron 1 e região promotora, respectivamente, no gene prnp bovino da raça Caracu, para posterior indicação de animais geneticamente suscetíveis ou resistentes à EEB. Foi realizada a extração de DNA genômico de sangue e sêmen de 27 reprodutores da raça Caracu com baixo ou nenhum grau de parentesco. As regiões alvo do gene prnp foram amplificadas pela PCR, utilizando-se primers específicos, e submetidas à eletroforese em gel de agarose a 3 % para realização da genotipagem. Os produtos das PCRs foram purificados e sequenciados. Na análise do gel, os animais apresentaram os genótipos ins/del (um alelo com inserção e o outro com deleção de pb, sendo heterozigoto), del/del (deleção nos dois alelos, sendo homozigotos), ins/ins (inserção nos dois alelos, sendo também homozigotos). No sequenciamento, confirmaram-se os polimorfismos nas regiões estudadas. Os animais apresentaram alta frequência alélica característica de resistência à EEB para as duas regiões polimórficas estudadas. A frequência do haplótipo e diplótipo característicos de resistência foi de 48 % e 41 %, respectivamente. Estes resultados são de grande importância para a seleção de reprodutores com perfil genético de resistência, pois animais com esta característica poderão ser inseridos em programas de melhoramento animal

INDEL de 12 e 23 pares de bases no gene da PRÍON bovina na raça Caracu.

A Encefalopatia Espongiforme Bovina (EEB) é uma zoonose que faz parte do grupo das Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (EETs). O agente etiológico é denominado de príon scrapie (PrPSc), que é uma proteína anormal. A proteína normal é a príon celular (PrPC), sintetizada a partir do gene prnp. Uma das mudanças que ocorrem no gene prnp em bovinos é a inserção e/ou deleção (indel) de sequências de bases, que podem ter um impacto sobre a formação da príon e, portanto, sobre a suscetibilidade ou resistência à EEB. Neste estudo, objetivou-se genotipar a variabilidade de nucleotídeos de 12 e 23 pares de bases (pb) indel em regiões específicas do íntron 1 e região promotora, respectivamente, no gene prnp bovino da raça Caracu, para posterior indicação de animais geneticamente suscetíveis ou resistentes à EEB. Foi realizada a extração de DNA genômico de sangue e sêmen de 27 reprodutores da raça Caracu com baixo ou nenhum grau de parentesco. As regiões alvo do gene prnp foram amplificadas pela PCR, utilizando-se primers específicos, e submetidas à eletroforese em gel de agarose a 3 % para realização da genotipagem. Os produtos das PCRs foram purificados e sequenciados. Na análise do gel, os animais apresentaram os genótipos ins/del (um alelo com inserção e o outro com deleção de pb, sendo heterozigoto), del/del (deleção nos dois alelos, sendo homozigotos), ins/ins (inserção nos dois alelos, sendo também homozigotos). No sequenciamento, confirmaram-se os polimorfismos nas regiões estudadas. Os animais apresentaram alta frequência alélica característica de resistência à EEB para as duas regiões polimórficas estudadas. A frequência do haplótipo e diplótipo característicos de resistência foi de 48 % e 41 %, respectivamente. Estes resultados são de grande importância para a seleção de reprodutores com perfil genético de resistência, pois animais com esta característica poderão ser inseridos em programas de melhoramento animal

Identificação do gene pccB A partir da varredura de uma biblioteca genômica de Corynebacterium pseudotuberculosis visando uma vacina contra linfadenite caseosa.

Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa (LC), que acomete principalmente ovinos e caprinos. Esta doença é causadora de grandes problemas na ovinocaprinocultura. Diversas pesquisas tem sido realizadas na busca de uma vacina eficaz contra a LC. Estudos recentes utilizando um gene reporter em C. pseudotuberculosis, identificou a expressão do gene pccB (cadeia β da propionil CoA carboxilase) em macrófagos, indicando um possível envolvimento na virulência deste patógeno e um bom antígeno a ser explorado no desenvolvimento de uma nova estratégia vacinal. Como a sequência deste gene ainda não está disponível em banco de dados, o objetivo deste trabalho foi realizar varredura em uma biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis para identificação completa da sequência do gene pccB. Uma sonda foi gerada a partir de um fragmento parcial do gene pccB marcado com [α32P]dCTP. A biblioteca genômica foi plaqueada em placas de lise para obter 2X103 pfu/placa e em seguida transferida para membranas de nylon previamente tratadas com soluções desnaturante, neutralizante e de pré-hibridização, a fim de, posteriormente, reagir com a sonda radioativa seguido da exposição das membranas a um filme de raio X. Dois clones positivos foram isolados e utilizados como template em reação de PCR, utilizando primers específicos da biblioteca genômica, gerando produtos de 3 Kb que foram sequenciados e analisados por BlastX, verificando-se 82% de identidade com o gene pccB2 de C. diphtheriae. Acreditando que haja sintenia entre as duas espécies mencionadas, foram desenhados primers com genes que flanqueiam o gene pccB2 de C. diphtheriae. Esses foram utilizados como iniciadores em reação de PCR, tendo como molde o DNA genômico de C. Pseudotuberculosis, gerando um fragmento de 2,1 Kb que foi clonado no vetor pGEM-T easy, sequenciado e analisado por BlastX. Resultados preliminares indicam que novos primers precisam ser desenhados para concluir a sequência deste gene

Polymorphisms of Intron 1 and the Promoter Region at the PRNP Gene in BSE-Free Caracu Cattle.

201

ELISA com MSP5 recombinante truncada para detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale em bovinos.

Os objetivos buscados pelos autores neste estudo foram produzir e solubilizar a proteína MSP5 recombinante truncada de Anaplasma marginale e avaliar seu desempenho em um ensaio de imunoadsorção enzimática indireto para detecção de anticorpos contra a riquétsia. O gene msp5, exceto a região N-terminal hidrofóbica, foi amplificado por reação em cadeia da polimerase, clonado em plasmídeo pTrcHis-TOPO e expresso em Escherichia coli. A solubilização da proteína recombinante foi avaliada em diferentes pHs e concentrações de uréia. A sensibilidade e a especificidade do ensaio foram avaliados testando-se 66 soros de animais infectados experimentalmente com A. marginale e 96 soros negativos, com o estado de infecção desses animais confirmado por reação em cadeia da polimerase. Um total de 1.666 amostras de soros bovinos, provenientes do Brasil - Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) e Minas Gerais (267), assim como do Uruguai (32) e Costa Rica (803) foram testadas nos ELISAs com MSP5 truncada e com MSP1a recombinantes, e a concordância entre os dois testes foi avaliada. O ELISA indireto com MSP5 truncada foi capaz de detectar animais infectados com 96,97% de sensibilidade e 100% de especificidade. Nos animais infectados experimentalmente, o ELISA detectou anticorpos do 12o dia após a inoculação (DPI) até o último dia de observação (37o DPI). Os ELISAs para MSP5 e MSP1a apresentaram concordância de 95,67%, com índice kappa de 0,81. Os resultados discordantes apresentaram uma diferença significativa (P < 0,001). Anticorpos contra A. marginale foram detectados em animais de todas asregiões estudadas. O ELISA com MSP5 recombinante truncada apresentou bom desempenho na detecção de anticorpos contra A. marginale, com alta sensibilidade e especificidade, representando uma importante ferramenta para o diagnóstico da anaplasmose bovina em estudos epidemiológicos.bitstream/CNPGC-2009-09/12411/1/DOC163.pd