A Novel Conductometric Urea Biosensor with Improved Analytical Characteristic Based on Recombinant Urease Adsorbed on Nanoparticle of Silicalite

Development of a conductometric biosensor for the urea detection has been reported. It was created using a non-typical method of the recombinant urease immobilization via adsorption on nanoporous particles of silicalite. It should be noted that this biosensor has a number of advantages, such as simple and fast performance, the absence of toxic compounds during biosensor preparation, and high reproducibility (RSD = 5.1 %). The linear range of urea determination by using the biosensor was 0.05–15 mM, and a lower limit of urea detection was 20 μM. The bioselective element was found to be stable for 19 days. The characteristics of recombinant urease-based biomembranes, such as dependence of responses on the protein and ion concentrations, were investigated. It is shown that the developed biosensor can be successfully used for the urea analysis during renal dialysis

ФЕРМЕНТНІ БІОСЕНСОРИ ДЛЯ КІЛЬКІСНОГО АНАЛІЗУ КОМПОНЕНТІВ ВИНА

Characteristics of enzymatic amperometric biosensors for quantitative analysis of wine’s components created during last years were presented and their main advantages and disadvantages were described.В обзоре приведена характеристика ферментных биосенсоров для количественного анализа компонентов вина, которые были созданы на протяжении последних лет, и проанализированы их основные преимущества и недостатки.В огляді наведено характеристику ферментних біосенсорів для кількісного визначення компонентів вина, які були створені протягом останніх років, та проаналізовано їхні основні переваги та недоліки

РОЗРОБКА АМПЕРОМЕТРИЧНОЇ БІОСЕНСОРНОЇ СИСТЕМИ ДЛЯ ОДНОЧАСНОГО ВИМІРЮВАННЯ ПІРУВАТУ І ЛАКТАТУ

This article describes the development of a biosensor system consisting of two monobiosensors based on pyruvate and lactate oxidases for determination pyruvate and lactate, respectively. For the enzymes immobilization in the bioselective membrane, the method of capturing into PVA-SbQ polymer on the surface of amperometric transducer was used. Platinum disk electrodes served as the transducers. The processes of production of both monobiosensors as well as the conditions of their operation were identical, which makes their integration into a single system possible. The conditions of enzymes immobilization and parameters of buffer solution (pH, buffer capacity, ionic strength) were optimized and universalized for simultaneous operation of biosensors. The cross influence of substrates and cofactors on enzymes was examined. The biosensor system is characterized by high degree of operational stability and reproducibility to responses to pyruvate and lactate. The obtained analytical characteristics of the biosensor system testify to the possibility of efficient usage for lactate and pyruvate analyses in real biological fluids. В работе описана разработка биосенсорной системы, состоящая из двух монобиосенсоров на основе пируватоксидазы и лактатоксидазы для определения пирувата и лактата, соответственно. Для иммобилизации ферментов в биоселективную мембрану был использован метод захвата ферментов в полимер PVA-SbQ на поверхности амперометрического преобразователя. В качестве преобразователей выступали платиновые дисковые электроды. В работе подобраны единые условия изготовления и функционирования монобиосенсоров для объединения в единую биосенсорную систему. Были подобраны оптимальные условия иммобилизации ферментов, параметры буферного раствора, такие как рН, буферная емкость и ионная сила, для одновременной работы биосенсоров. Также было проверено перекрестное влияние субстратов и кофакторов на ферменты. Биосенсорная система характеризировалась хорошей операционной стабильностью и воспроизводимостью откликов на лактат и пируват. Полученные аналитические характеристики биосенсорной системы свидетельствуют о возможности ее успешного использования для анализа лактата и пирувата в реальных биологических образцах. В роботі описано розробку біосенсорної системи, що складається з двох монобіосенсорів на основі піруватоксидази та лактатоксидази для визначення пірувату та лактату, відповідно. Для іммобілізації ензимів у складі біоселективної мембрани було використано метод захоплення в полімер PVA-SbQ на поверхні амперометричного перетворювача. Як перетворювачі виступали платинові дискові електроди. В роботі було підібрано єдині умови виготовлення та функціонування монобіосенсорів для поєднання їх у біосенсорну систему. Було досліджено оптимальні умови іммобілізації ензимів та параметри буферного розчину для одночасної роботи біосенсорів, зокрема рН, буферну ємність та іонну силу. Перевірено перехресний вплив субстратів та кофакторів на роботу ензимів. Біосенсорна система характеризувалась гарною операційною стабільністю та відтворюваністю відгуків на піруват та лактат. Отримані аналітичні характеристики біосенсорної системи свідчать про можливість її використання для аналізу лактату та пірувату в реальних біологічних рідинах.

ДОСЛІДЖЕННЯ НАПІВПРОВІДНИКОВИХ СТРУКТУР ДЛЯ РОЗРОБКИ рН-ЧУТЛИВИХ ПОЛЬОВИХ ТРАНЗИСТОРІВ

PH-sensitivity, stability and drift of semiconductors structures with various quality and type of surface dielectric layer have been investigated. Their parameters for creation of pH-sensitive field effect transistors were optimised. The best results were obtained for two-layer structure of dielectric that consists of SiO2 and Si3 N4 . These structures were proposed for development of pHsensitive field effect transistors. The best characteristics were shown by transducers created at R&D Institute “Microdevice” (Kiev, Ukraine).В работе исследованы рН-чуствительность и дрейф полупроводниковых структур з различным количеством и типом поверхностного диэлектрика и оптимизированы их параметры для создания рН-чуствительных полевых транзисторов. Лучшие результаты были получены для двухслойного диэлектрика, который состоял из SiO2 и Si3 N4 , который и предложено для разработки рН-чуствительных полевых транзисторов. Лучшие характеристки продемонстрировали преобразователи, изготовленные в НИИ “Микроприбор” (Киев, Украина).В роботі досліджено рН-чутливість, стабільність та дрейф напівпровідникових структур з різною кількістю та типом поверхневого діелектрика та оптимізовано їх параметри для створення рН-чутливих польових транзисторів. Кращі результати були отримані для двошарового діелектрика, що складається з SiO2 і Si3 N4 , який і запропоновано для розробки рН-чутливих польових транзисторів. Кращі характеристики демонстрували перетворювачі, виготовлені в НДІ “Мікроприлад” (Київ, Україна)

ВИВЧЕННЯ МОЖЛИВОСТЕЙ ПРАКТИЧНОГО ЗАСТОСУВАННЯ ПОТЕНЦІОМЕТРИЧНИХ БІОСЕНСОРІВ ДЛЯ АНАЛІЗУ ГЛЮКОЗИ В КРОВІ ЛЮДИНИ

The possibilities of practical application of biosensors based on pH-sensitive field-effect transistors and glucose oxidase for qualitative analysis of glucose in real blood samples have been studies. The main analytical characteristics of biosensors developed were optimized, and the optimal conditions of measurements in real samples were determined. It was shown that biosensor developed could be used for glucose analysis in human blood.Изучены возможности практического применения биосенсоров на основе рН-чувствительных полевых транзисторов и глюкозооксидазы для количественного анализа содержания глюкозы в реальных образцах крови человека. Оптимизированы основные аналитические характеристики разработанных биосенсоров, определены оптимальные условия для проведения измерений в реальных образцах. Показано, что разработанный биосенсор можно с успехом использовать для анализа глюкозы в крови человека.Вивчено можливості практичного застосування біосенсорів на основі рН-чутливих польових транзисторів та глюкозооксидази для кількісного аналізу концентрації глюкози в зразках крові людини. Оптимізовано основні аналітичні характеристики розроблених біосенсоров, визначено оптимальні умови для проведення вимірювань з реальниими зразками крові. Показано, що розроблений біосенсор можна з успіхом використовувати для аналізу глюкози в крові людин

ОПТИМІЗАЦІЯ ПРОЦЕДУРИ РОЗДІЛЬНОГО БІОСЕНСОРНОГО ВИЗНАЧЕННЯ АФЛАТОКСИНІВ ТА ПЕСТИЦИДІВ

A procedure of separate biosensor analysis of the multicomponent sample with aflatoxins and pesticides has been developed and optimized. Biosensor determination of aflatoxins and pesticides was performed using enzyme inhibition analysis. For creation of bioselective element we used enzyme acetylcholinesterase which is co-immobilized with bovine serum albumin on the surface of potentiometric transducer by glutaraldehyde covalent crosslinking. As transducers were pH-sensitive field effect transistors. The concentration of acetylcholine chloride as a substrate for subsequent inhibition analysis was fit; optimal time of inhibition by toxins solution was determinate together with concentration of reactivator (pyridine-2-aldoxymmethyliodyd) and time of enzyme reactivation after inhibition. A synergism between trichlorfon and aflatoxin B1 in inhibition of immobilized on a surface pH-sensitive field-effect transistors acetylcholinesterase was investigated. The proposed procedure allows selective determination the composition of the multicomponent sample with aflatoxins and pesticidesРазработана и оптимизирована процедура биосенсорного анализа мультикомпонентного образца, в составе которого есть как афлатоксины, так и пестициды. Биосенсорное определение афлатоксинов и пестицидов проводили с использованием ингибиторного ферментного анализа. Для создания биоселективного элемента биосенсора использовали ферментацетилхолинэстераза, коиммобилизованный с бычьим сывороточным альбумином с помощью ковалентной сшивки глутаровым альдегидом на поверхности потенциометрического преобразователя. В качестве преобразователей выступали рН-чувствительные полевые транзисторы.Подобраны рабочая концентрация ацетилхолина как субстрата для дальнейшего ингибиторного анализа, оптимальное время ингибирования раствором токсинов, необходимая концентрация реактиватора пиридин-2-альдоксимметилйодид и время реактивации ферментной мембраны послеее ингибирования. Исследован синергизм действия трихлорофона и афлатоксина В1 при ингибировании ими иммобилизованной на поверхность рН-чувствительных полевых транзисторов ацетилхолинэстеразы. Предложенная процедура анализа позволяет селективно определять состав мультикомпонентного образца, в составе которого есть как афлатоксины, так и пестициды.Розроблено та оптимізовано процедуру біосенсорного аналізу мультикомпонентного зразку, в складі якого є як афлатоксини, так і пестициди. Біосенсорне визначення афлатоксинів та пестицидів проводили з використанням інгібіторного ферментного аналізу. Для створення біоселективного елементу біосенсора використовували фермент ацетилхолінестеразу, коіммобілізовану з бичачим сироватковим альбуміном за допомогою ковалентної зшивки глутаровим альдегідом на поверхні потенціометричного перетворювача. Як перетворювачі виступали рН-чутливі польові транзистори. Підібрано робочу концентрацію ацетилхоліну як субстрату для подальшого інгібіторного аналізу, оптимальний час інгібування розчином токсинів, необхідну концентрацію реактиватора піридин-2-альдоксимметилйодиду та часу реактивації ферментної мембрани після її інгібування. Досліджено синергізм дії трихлорофону та афлатоксину В1 при інгібуванні ними іммобілізованої на поверхню рН-чутливих польових транзисторів ацетилхолінестерази. Запропоновано процедуру аналізу, яка дозволяє селективно визначати склад мультикомпонентного зразку, в складі якого є як афлатоксини, так і пестициди

КОНДУКТОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР НА ОСНОВІ ТРИФЕРМЕНТНОЇ СИСТЕМИ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО ВИЗНАЧЕННЯ ІОНІВ ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

The data on development of highly sensitive and selective conductometric biosensor for determination of heavy metal ions are presented. A differential pair of gold planar thin-film interdigitated electrodes deposited on the ceramic substrate was used as a conductometric transducer. As a bioselective element, the three-enzyme system (invertase, mutarotase, glucose oxidase) immobilized on the transducer surface was more sensitive and selective to heavy metal ions as compared with other enzymatic systems due to summary inhibition effect of three enzymes. The enzymes ratio in mem-brane was chosen experimentally taking into consideration obtaining maximal biosensor sensitivity both to the substrate (sucrose) and to heavy metal ions. The optimum time of the biosensor incubation in solution of toxic compounds, required to ensure necessary sensitivity was determined to be 30 min. The calibration curves for determination of different heavy metal ions were obtained. The biosensor selectivity to other groups of toxins was studied too. The biosensor developed is characterized in high sensitivity and selectivity to Hg2+ and Ag+ in comparison with known biosensors for heavy metal ions analysis. Therefore it can be recommended at express analysis of heavy metals in ecological monitoring.В работе представлены данные по разработке высокочувствительного селективного кондуктометрического биосенсора для определения ионов тяжелых металлов. Как кондуктометрический преобразователь использовалась дифференциальная пара золотых планарных гребенчатых электродов, нанесенных на ситаловую подложку. Роль биоселективного элемента выполняла трехферментная система (инвертаза, мутаротаза, глюкозооксидаза), иммобилизованная на поверхность преобразователя. Эта трехферментная система была более чувствительна и селективна по сравнению с другими ферментными системами за счет суммарного эффекта ингибирования трех ферментов. Соотношения ферментов в мембране подбирали экспериментально, принимая во внимание достижение наибольшей чувствительности биосенсора как к субстрату (сахарозе), так и к ионам тяжелых металлов. В работе установлено оптимальное время инкубации биосенсора в растворе токсинов, которое составляло 30 минут. Получены калибровочные кривые для определения разных ионов тяжелых металлов кондуктометрическим биосенсором. Также была проверена его селективность относительно других групп токсинов. Разработанный биосенсор характеризовался высокой чувствительностью и селективностью к ионам Hg2+ и Ag+, по сравнению с известными на данный момент биосенсорами для анализа тяжелых металлов. Потому он может быть использован в качестве экспресс-метода при анализе реальных образцов в экологическом мониторинге.В роботі представлено дані щодо розробки високочутливого селективного кондуктометричного біосенсора для визначення іонів важких металів у водних розчинах. Як кон- дуктометричний перетворювач використовувалася диференційна пара планарних золотих гребінчастих електродів, нанесених на ситалову підкладку. Роль біоселективного елементу відігравала триферментна система (інвертаза, мутаротаза, глюкозооксидаза), іммобілізована на поверхню перетворювача, яка є чутливішою і селективнішою у порівнянні з іншими ферментними системами за рахунок сумарного ефекту інгібування трьох ферментів. Співвідношення ферментів в мембрані підбирали експериментально, маючи на меті досягнення найбільшої чутливості біосенсора як до субстрату (сахарози), так і до важких металів. В роботі встановлено оптимальний час інкубації біосенсора в розчині токсинів для отримання необхідної чутливості, який становив 30 хвилин. Отримано калібрувальні криві для визначення різних іонів важких металів кондуктометричним біосенсором та перевірено його селективність щодо інших груп токсинів. Розроблений біосенсор характеризується більшою чутливістю та селективністю до іонів Hg2+ та Ag+ у порівнянні з відомими на даний момент біосенсорами для аналізу важких металів і може бути рекомендований при експрес-аналізі реальних зразків в екологічному моніторингу

АДАПТАЦІЯ ПРОЦЕДУРИ НАНЕСЕННЯ ПОЛІФЕНІЛЕНДІАМІНОВОЇ МЕМБРАНИ НА ДИСКОВІ ПЛАТИНОВІ ПЕРЕТВОРЮВАЧІ

The biosensor selectivity is an important factor when working with real biological fluids and other complex samples; therefore, study on the biosensor selectivity towards possible interfering compounds and its improvement is a mandatory step in the development of biosensors. In case of amperometric biosensors, the main interfering compounds are electroactive substances able to oxidize on the working electrode and generate electric current. To eliminate the impact of these compounds, the deposition of semipermeable membranes onto transducer surface may be used, the procedure being methodologically simple and having no significant effect on the biosensor performance.The aim of this work was to optimize the conditions of deposition of polyphenylenediamine (PPD) based semipermeable membrane onto amperometric transducers.Methods: Amperometric method of analysis was used. Platinum disc electrodes served as amperometric transducers, they were connected to potentiostat PalmSens (Netherlands) via three-electrode measurement circuit. PPD membranes were deposited onto transducers by phenylenediamine electropolymerisation at a constant or variable potential.Results: The transducers sensitivity to a number of electroactive substances was determined before and after deposition of the additional semipermeable membrane by different methods. The efficiency of PPD membrane deposited at different time of electropolymerisation and various concentrations of monomer m-phenylene diamine was studied. The transducers were shown to remain insensitive to the electroactive substances over long-term use and during one-week storage.Conclusion: The PPD membrane deposited under optimal conditions allows virtual elimination of transducers sensitivity to interfering substances (ascorbic acid, cysteine, uric acid and dopamine). Therefore, the transducers modified with PPD membranes can be effectively used to work with real biological samples such as blood serum assays.Селективность амперометрических биосенсоров зависит от чувствительности преобразователей к электроактивным веществам. Одним из вариантов уменьшения чувствительности преобразователей к электроактивным веществам является нанесение на них полупроницаемых мембран. Целью данной работы была оптимизация условий нанесения полупроницаемой мембраны на основе полифенилендиамина (ПФД) на амперометрические преобразователи, в качестве которых использовали дисковые платиновые электроды. В работе было проверено чувствительность преобразователей к ряду электроактивных веществ до и после нанесения полупроницаемой мембраны. Исследована эффективность ПФД мембраны, нанесенной при разной продолжительности электрополимеризации и различных концентрациях мономера м-фенилендиамина, и выбраны оптимальные условия электрополимеризации. Показано, что преобразователи остаются нечувствительными к электроактивным веществам при длительной работе и во время хранения в течение недели. Согласно приведенным результатам, преобразователи, модифицированные ПФД мембраной, можно эффективно использовать для работы с реальными биологическими образцами, такими как сыворотка крови.Селективність біосенсора є важливим фактором при роботі з реальними біологічними рідинами та іншими складними зразками, тому дослідження та покращення селективності біосенсора до можливих інтерферуючих сполук є обов’язковим етапом при розробці біосенсорів. У випадку амперометричних біосенсорів головними інтерферуючими сполуками виступають електроактивні речовини, які здатні окиснюватись на робочому електроді і генерувати струм. Для усунення впливу даних сполук можливе нанесення напівпроникних мембран на перетворювачі, що є методологічно простою процедурою і незначно впливає на роботу біосенсорів.Метою даної роботи була оптимізація умов нанесення напівпроникної мембрани на основі поліфенілендіаміну (ПФД) на амперометричні перетворювачі.Методи дослідження: В роботі використовували амперометричний метод аналізу. Як амперометричні перетворювачі в роботі використовували платинові дискові електроди, які за триелектродною схемою вимірювання приєднувались до потенціостату PalmSens (Нідерланди). Нанесення ПФД мембрани на перетворювачі проводили шляхом електрополімеризації фенілендіаміну при прикладанні до електродів постійного чи змінного потенціалу.Результати дослідження: Перевірено чутливість перетворювачів до ряду електроактивних речовин до та після нанесення різними методами додаткової напівпроникної мембрани. Досліджено ефективність ПФД мембрани, нанесеної при різній тривалості електрополімеризації та різних концентраціях мономеру м-фенілендіаміну. Показано, що перетворювачі залишаються нечутливими до електроактивних речовин при тривалій роботі та під час зберігання протягом тижня.Висновки: Нанесена за оптимальних умов ПФД мембрана дозволяє практично повністю усунути чутливість перетворювачів до інтерферуючих речовин (аскорбінової кислоти, цистеїну, сечової кислоти та дофаміну), тому перетворювачі, модифіковані ПФД мембраною, можна ефективно використовувати для роботи з реальними біологічними зразками, такими як сироватка крові

Improvement of amperometric transducer selectivity using nanosized phenylenediamine films

Abstract In this work, we studied the conditions of deposition of a semipermeable polyphenylenediamine (PPD)-based membrane on amperometric disk platinum electrodes. Restricting an access of interfering substances to the electrode surface, the membrane prevents their impact on the sensor operation. Two methods of membrane deposition by electropolymerization were compared—at varying potential (cyclic voltammetry) and at constant potential. The cyclic voltammetry was shown to be easier in performing and providing better properties of the membrane. The dependence of PPD membrane effectiveness on the number of cyclic voltammograms and phenylenediamine concentration was analyzed. It was shown that the impact of interfering substances (ascorbic acid, dopamine, cysteine, uric acid) on sensor operation could be completely avoided using three cyclic voltammograms in 30 mM phenylenediamine. On the other hand, when working with diluted samples, i.e., at lower concentrations of electroactive substances, it is reasonable to decrease the phenylenediamine concentration to 5 mM, which would result in a higher sensitivity of transducers to hydrogen peroxide due to a thinner PPD layer. The PPD membrane was tested during continuous operation and at 8-day storage and turned out to be efficient in sensor and biosensors