Dynamic single cell measurements of kinase activity by synthetic kinase activity relocation sensors.

BACKGROUND: Mitogen activated protein kinases (MAPK) play an essential role in integrating extra-cellular signals and intra-cellular cues to allow cells to grow, adapt to stresses, or undergo apoptosis. Budding yeast serves as a powerful system to understand the fundamental regulatory mechanisms that allow these pathways to combine multiple signals and deliver an appropriate response. To fully comprehend the variability and dynamics of these signaling cascades, dynamic and quantitative single cell measurements are required. Microscopy is an ideal technique to obtain these data; however, novel assays have to be developed to measure the activity of these cascades. RESULTS: We have generated fluorescent biosensors that allow the real-time measurement of kinase activity at the single cell level. Here, synthetic MAPK substrates were engineered to undergo nuclear-to-cytoplasmic relocation upon phosphorylation of a nuclear localization sequence. Combination of fluorescence microscopy and automated image analysis allows the quantification of the dynamics of kinase activity in hundreds of single cells. A large heterogeneity in the dynamics of MAPK activity between individual cells was measured. The variability in the mating pathway can be accounted for by differences in cell cycle stage, while, in the cell wall integrity pathway, the response to cell wall stress is independent of cell cycle stage. CONCLUSIONS: These synthetic kinase activity relocation sensors allow the quantification of kinase activity in live single cells. The modularity of the architecture of these reporters will allow their application in many other signaling cascades. These measurements will allow to uncover new dynamic behaviour that previously could not be observed in population level measurements

DYNAMIC SINGLE CELL MEASUREMENTS OF SIGNALLING CASCADE ACTIVITY

All organisms are composed of a multitude of cell types, having each a specific task to accom- plish. This cell-to-cell heterogeneity results from a complex process of differentiation initiated by the interpretation of intra and extracellular cues by signalling cascades. Therefore, it becomes fundamental to study the signal processing driven by signalling cascades, in order to understand how cells organise during development, but also to comprehend how and why signals are some- times misinterpreted and lead to diseases such as cancer. MAPK pathways belong to a very well-conserved family of signalling cascades, known to be mostly implicated in the adaptation to environmental stimuli and to regulate various key physiological processes. The various com- ponents of the MAPK pathways are well defined. However, we still need to understand how signalling cascades cross-communicate with each other and how this leads to different cell-fate decision making. The limitation is mostly technical, as such investigation would require to dy- namically and simultaneously investigate the activity state of MAPK components in live single cells. The aim of this thesis was to build a new kind of assay, enabling to extract these inform- ation. Here, I described the design of the synthetic protein SKARS, that relocates from the nucleus to the cytoplasm following specific phosphorylation. This synthetic protein is composed of a docking site (DS), that enables a specific interaction with a MAP kinase, a nuclear local- isation sequence (NLS), that promotes an active nuclear importation, and a fluorescent protein (FP), that allows to determine its sub-cellular localisation. Once the cell activates the MAPK, the NLS gets inhibited by phosphorylation, which leads to the cytoplasmic accumulation of the fluorescent protein. This nucleus-to-cytoplasm shuttling is used as a proxy for MAPK activity. In order to demonstrate this, we applied this technology in the mating pathway study of the model organism Saccharomyces cerevisiae. By combining time-lapse fluorescent microscopy with com- putational analysis, we extracted the dynamic MAPK activity in hundreds of cells, and observed that when cells are exposed to exogenous pheromone, the MAPK is differentially activated from one cell to another. Using the Whi5 transcription factor as a sensor for the cell cycle progression, we showed that these different signal patterns are specific to the cell-cycle stage of the cell. The MAPK is fully activated in G1, inhibited in S, G2 and M and transiently activated during the transition between G1 and S. Moreover, single cell analysis of mutants let us conclude that the model describing how the cell cycle regulates the mating pathway is incomplete. To conclude, we showed that the parallel measurement of multiple signalling cascades is a valuable strategy enlighten very subtle pathway cross-regulation events. Thanks to the straightforward structure of the SKARS, crosstalk mechanisms between signalling cascades can be assessed, by combining multiple sensors in the same cell. We are currently applying this technology to mammalian cells, and strongly believe that this technique can be an advantage in fields such as development or cancer research. -- Tous les organismes sont composés d’une multitude de cellules ayant chacune une tâche spéci- fique à accomplir. Cette hétérogénéité résulte d’un processus complexe de différenciation initié par l’analyse de signaux intracellulaires et extracellulaires par des cascades de signalisation. Par conséquent, il devient fondamental d’étudier le traitement du signal par les voies de signalisation pour comprendre comment les cellules s’organisent pendant le développement, mais aussi pour comprendre comment et pourquoi ces signaux peuvent parfois être mal interprétés et entraîner l’apparition de maladies telles que le cancer. Les voies impliquant les MAP Kinases (MAPK) appartiennent à une famille très bien conservée de cascades de signalisation connues pour leurs rôles dans l’adaptation aux stimuli environnementaux et dans la régulation de divers processus physiologiques clés. Les différents composants des voies impliquant les MAPK commencent à être bien connus. Cependant, nous ne comprenons toujours pas comment les cascades de signalisa- tion s’autorégulent et comment cela conduit à divers comportements cellulaires. La limitation est principalement technique, car une telle recherche nécessiterait de sonder l’état d’activité des com- posants des cascades de MAPK, dynamiquement et simultanément dans chaque cellule vivante. L’objectif de cette thèse fut de construire un nouveau type de senseur permettant d’extraire ces informations. Dans ce manuscrit, nous décrivons le design, ainsi qu’une application de la protéine synthétique SKARS (Synthetic Kinase Activity Relocation Sensor). Elle a été conçue pour se déplacer du noyau vers le cytoplasme après avoir été spécifiquement phosphorylée par la kinase d’intérêt. La protéine est composée d’un domaine de docking (DS), qui permet une interaction spécifique avec une MAPK, un signal de localisation nucléaire (NLS), qui favorise une importation active dans le noyau et une protéine fluorescente pour observer sa position dans les compartiments cellulaires. Une fois que la cellule active la MAPK, le NLS est inhibé après phosphorylation ce qui conduit à l’accumulation de la protéine fluorescente dans le cytoplasme. Le passage du noyau au cytoplasme est utilisé comme mesure de l’activité MAPK. Comme preuve de concept, nous avons appliqué cette technologie dans l’étude de la voie d’accouplement chez l’organisme modèle Saccharomyces cerevisiae. En combinant la microscopie à fluorescence en temps réel avec une analyse informatique, nous avons extrait l’activité dynamique de la MAPK dans des centaines de cellules et avons observé que lorsque les cellules sont exposées à de la phéromone exogène, la MAPK s’active de manière différente d’une cellule à l’autre. En utilisant le facteur de transcription Whi5 comme senseur de la progression du cycle cellulaire, nous avons montré que ces différents types de trace d’activité de MAPK sont spécifiques à chaque phase du cycle cellulaire dans laquelle se trouve la cellule. La MAPK est entièrement activée en G1, inhibée en S, G2 et M et activée de manière transitoire à l’interaction entre G1 et S. De plus, l’analyse de cellule mutantes individuellement nous a permis de conclure que le modèle décrivant le mécanisme de régulation de la voie d’accouplement par le cycle cellulaire est incomplet. Pour conclure, la mesure en parallèle de plusieurs cascades de signalisation est une stratégie intéres- sante pour détecter de fins événements de régulation entre les voies de signalisation. Grâce à sa structure modulable, plusieurs SKARS peuvent être construits et combinés dans le but d’étudier les mécanismes de régulation croisés entre les cascades de signalisation. Nous appliquons actuel- lement cette technologie aux cellules mammifères et nous sommes fermement convaincus que cette technique pourrait bénéficier à divers domaines tels que la recherche sur le développement ou la recherche sur le cancer. -- La cellule est l’unité biologique structurelle et fonctionnelle fondamentale de tous les êtres vi- vants. Chez l’homme, les cellules s’assemblent pour former des structures complexes telles que des organes, des muscles ou des os. Bien que la plupart des cellules qui composent notre corps possèdent exactement le même code génétique, chacune d’entre elles se différencie, entre autres, par sa fonction. Cette diversité émerge d’une interprétation différente des changements envi- ronnementaux. L’analyse de ces signaux se fait à l’intérieur de la cellule par un grand réseau de protéines. Ce réseau s’apparente à un circuit électrique, où chaque interrupteur est relié à un ou plusieurs autres interrupteurs. Au niveau cellulaire, à chaque interrupteur correspond une protéine faisant circuler le signal dans une branche précise du réseau en contrôlant son état “ON/OFF”. Suivant le type de chemin parcouru, le signal induira un type de réponse ou un autre. Ce processus est communément appelé transduction du signal. Si la transduction du signal d’une cellule était mesurée, sa voie de différenciation cellulaire serait anticipée. Cette thèse présente une technique permettant de mesurer la transduction du signal dans des cellules vivantes et en temps réel. La technique se base sur une protéine synthétique appelée SKARS qui va agir comme une sonde pour l’activité d’un nœud du circuit de signalisation. Lorsque le nœud n’est pas actif, la protéine est dans le noyau de la cellule et lorsque le nœud s’active, la protéine s’accumule en dehors. Afin de visualiser ce processus, la sonde à été marquée avec une protéine fluorescente. En utilisant un microscope à fluorescence, nous pouvons suivre la position de la sonde au cours du temps et en déduire le degré d’activation du nœud mesuré. Nous avons appliqué cette méthode dans l’étude du processus d’accouplement chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Deux sondes ont été utilisées pour mesurer en parallèle l’activité du nœud de l’accouplement et du nœud impliqué dans le déclenchement de la division cellulaire. Nos résultats montrent que la voie de l’accouplement ne peut être activée qu’à condition que les cellules sentent de la phéromone et que la voie de la division cellulaire soit éteinte. Par conséquent, la cellule ne peut choisir que l’une de ces deux voies de différenciation. Grâce à cette méthode, nous avons aussi démontré que le modèle décrivant le mécanisme d’inhibition croisé de ces deux voies était incomplet. En conclu- sion, la sonde SKARS est outil extrêmement utile pour définir comment la cellule interprète les signaux de l’environnement et ainsi comprendre pourquoi certaines voies de différenciation sont choisies plus que d’autres. Cette sonde a été utilisée chez un organisme très simplifié, mais nous sommes convaincus que cette technique permettra de répondre à d’importantes questions dans les domaines de recherche sur le développement et sur le cancer

Traitement des signaux EMG et son application pour commander un exosquelette

Le vieillissement de la population dans notre société moderne va entraîner de nouveaux besoins pour l’assistance aux personnes âgées et pour la réhabilitation. Les exosquelettes sont une piste de recherche prenant de plus en plus d’importance pour répondre à ces nouveaux challenges. Deux de ces challenges sont, la réalisation d’un contrôle naturel pour l’utilisateur et la sécurité. Cette maîtrise cherche à répondre à ces deux problématiques. Nous avons donc développé un outil de travail informatique utilisant les décharges électriques produites par les neurones moteurs pour contracter les muscles et un modèle des os et des muscles du bras. Cet outil utilise la librairie informatique ROS et OpenSim. Elle permet de connaître la force et le mouvement développés par le coude. De plus, un autre outil informatique a été développé pour optimiser le modèle des os et des muscles du bras pour le personnaliser à l’utilisateur pour un meilleur résultat. Une carte d’acquisition utilisant des électrodes de surface pouvant être reliées avec un ordinateur par USB et compatible avec ROS a été développée. Pour tester les algorithmes développés, un exosquelette pour le coude utilisant un actionneur compliant et contrôlé en force a été conçu. Pour compenser le poids de l’exosquelette et l’effet d’amortissement passif de l’actionneur, une compensation de gravité dynamique a été développée. Finalement, des expérimentations ont été menées sur l’efficacité de l’optimisation du modèle et sur l’exosquelette avec les différents algorithmes

Real-time quantification of protein expression at the single-cell level via dynamic protein synthesis translocation reporters.

Protein expression is a dynamic process, which can be rapidly induced by extracellular signals. It is widely appreciated that single cells can display large variations in the level of gene induction. However, the variability in the dynamics of this process in individual cells is difficult to quantify using standard fluorescent protein (FP) expression assays, due to the slow maturation of their fluorophore. Here we have developed expression reporters that accurately measure both the levels and dynamics of protein synthesis in live single cells with a temporal resolution under a minute. Our system relies on the quantification of the translocation of a constitutively expressed FP into the nucleus. As a proof of concept, we used these reporters to measure the transient protein synthesis arising from two promoters responding to the yeast hyper osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase pathway (pSTL1 and pGPD1). They display distinct expression dynamics giving rise to strikingly different instantaneous expression noise

Robust simultaneous myoelectric control of multiple degrees of freedom in wrist-hand prostheses by real-time neuromusculoskeletal modeling

Objectives: Robotic prosthetic limbs promise to replace mechanical function of lost biological extremities and restore amputees' capacity of moving and interacting with the environment. Despite recent advances in biocompatible electrodes, surgical procedures, and mechatronics, the impact of current solutions is hampered by the lack of intuitive and robust man-machine interfaces. Approach: Based on authors' developments, this work presents a biomimetic interface that synthetizes the musculoskeletal function of an individual's phantom limb as controlled by neural surrogates, i.e. electromyography-derived neural activations. With respect to current approaches based on machine learning, our method employs explicit representations of the musculoskeletal system to reduce the space of feasible solutions in the translation of electromyograms into prosthesis control commands. Electromyograms are mapped onto mechanical forces that belong to a subspace contained within the broader operational space of an individual's musculoskeletal system. Results: Our results show that this constraint makes the approach applicable to real-world scenarios and robust to movement artefacts. This stems from the fact that any control command must always exist within the musculoskeletal model operational space and be therefore physiologically plausible. The approach was effective both on intact-limbed individuals and a transradial amputee displaying robust online control of multi-functional prostheses across a large repertoire of challenging tasks. Significance: The development and translation of man-machine interfaces that account for an individual's neuromusculoskeletal system creates unprecedented opportunities to understand how disrupted neuro-mechanical processes can be restored or replaced via biomimetic wearable assistive technologies

MyoSim:Fast and physiologically realistic MuJoCo models for musculoskeletal and exoskeletal studies

Owing to the restrictions of live experimentation, musculoskeletal simulation models play a key role in biological motor control studies and investigations. Successful results of which are then tried on live subjects to develop treatments as well as robot aided rehabilitation procedures for addressing neuromusculoskeletal anomalies ranging from limb loss, to tendinitis, from sarcopenia to brain and spinal injuries. Despite its significance, current musculoskeletal models are computationally expensive, and provide limited support for contact-rich interactions which are essential for studying motor behaviors in activities of daily living, during rehabilitation treatments, or in assistive robotic devices. To bridge this gap, this work proposes an automatic pipeline to generate physiologically accurate musculoskeletal, as well as hybrid musculoskeletal-exoskeletal models. Leveraging this pipeline we present MyoSim - a set of computationally efficient (over 2 orders of magnitude faster than state of the art) musculoskeletal models that support fully interactive contact rich simulation. We further extend MyoSim to support additional features that help simulate various real-life changes/diseases, such as muscle fatigue, and sarcopenia. To demonstrate the potential applications, several use cases, including interactive rehabilitation movements, tendon-reaffirmation, and the cosimulation with an exoskeleton, were developed and investigated for physiological correctness. Web-page: https://sites.google.com/view/myosuit