Loss of KEAP1 causes an accumulation of nondegradative organelles

KEAP1 is a cytoplasmic protein that functions as an adaptor for the Cullin-3-based ubiquitin E3 ligase system, which regulates the degradation of many proteins, including NFE2L2/NRF2 and p62/SQSTM1. Loss of KEAP1 leads to an accumulation of protein ubiquitin aggregates and defective autophagy. To better understand the role of KEAP1 in the degradation machinery, we investigated whether Keap1 deficiency affects the endosome-lysosomal pathway. We used KEAP1-deficient mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and combined Western blot analysis and fluorescence microscopy with fluorometric and pulse chase assays to analyze the levels of lysosomal-endosomal proteins, lysosomal function, and autophagy activity. We found that the loss of keap1 downregulated the protein levels and activity of the cathepsin D enzyme. Moreover, KEAP1 deficiency caused lysosomal alterations accompanied by an accumulation of autophagosomes. Our study demonstrates that KEAP1 deficiency increases nondegradative lysosomes and identifies a new role for KEAP1 in lysosomal function that may have therapeutic implications

El duende del bosque nos visita

El proyecto pretende mejorar el patio escolar creando diferentes zonas, como recurso didáctico para fomentar la integración entre todos los alumnos en un plano de igualdad. Los objetivos son crear un patio escolar con variados recursos de uso, aprendizaje y disfrute; mejorar la habitabilidad del patio y con ello la calidad de vida de los alumnos; valorar la importancia de juego para el aprendizaje; definir y diseñar zonas-rincones de intervención; potenciar la responsabilidad en el cuidado del entorno y en el propio aprendizaje; y favorecer una mayor atención a la diversidad. En cuanto a la metodología, se parte de un cuento en el que el Duende del bosque pide la colaboración de todos para cambiar el estado del patio. Se realiza una encuesta a los niños para conocer el tipo de juegos y las zonas que prefieren, los juegos que les gustaría tener, qué cambiarían en el patio, y qué echan en falta. A partir de estos datos se obtiene información sobre el diseño de la zona de descanso, la zona de juegos, los ajardinamientos, y la decoración. La difusión de información se realiza a través del periódico del AMPA y el Ayuntamiento colabora con la construcción del arenero, la adecuación de varias zonas, y la obtención de bancos y mesas. Se realiza una evaluación inicial, una evaluación continua, y una evaluación final, a través de observación, reuniones, cuestionarios y fotografías del patio antes y después de las modificaciones. Se incluye un disquete con la memoria..Madrid (Comunidad Autónoma). Consejería de EducaciónMadridMadrid (Comunidad Autónoma). Subdirección General de Formación del Profesorado. CRIF Las Acacias; General Ricardos 179 - 28025 Madrid; Tel. + 34915250893ES

The E1a Adenoviral Gene Upregulates the Yamanaka Factors to Induce Partial Cellular Reprogramming

The induction of pluripotency by enforced expression of different sets of genes in somatic cells has been achieved with reprogramming technologies first described by Yamanaka’s group. Methodologies for generating induced pluripotent stem cells are as varied as the combinations of genes used. It has previously been reported that the adenoviral E1a gene can induce the expression of two of the Yamanaka factors (c-Myc and Oct-4) and epigenetic changes. Here, we demonstrate that the E1a-12S over-expression is sufficient to induce pluripotent-like characteristics closely to epiblast stem cells in mouse embryonic fibroblasts through the activation of the pluripotency gene regulatory network. These findings provide not only empirical evidence that the expression of one single factor is sufficient for partial reprogramming but also a potential mechanistic explanation for how viral infection could lead to neoplasia if they are surrounded by the appropriate environment or the right medium, as happens with the tumorogenic niche

Análisis de extracto proteico por Western blotting

Se estudia cómo hacer el extracto proteico a partir de Western blotting. Para ello, se prepara para la transferencia de cada gel, dos papeles Whatman (Extra Thick Blod PAPER Bio-Rad), el uso de dos esponjillas y una membrana de PVDF. Todo deberá estar equilibrado en su tampón de transferencia antes de proceder a realizar el proceso de transferencia. Estas piezas deben estar embebidas durante al menos 10 minutos en tampón de trasferencia. Se aplicará una tensión de 75 V y migrar durante 45 minutos en agitación continua y refrigeración en el caso de los geles de 18 pocillos (Criterion TGX). El tampón utilizado en la transferencia de geles de 18 pocillos es el tampón Tris Glicina Metanol. El anticuerpo secundario se diluye de 1:5.000 a 1:10.000 en 10 % de leche desnatada en una solución de TTBS. La elección del anticuerpo secundario entre monoclonal o policlonal depende siempre del anticuerpo primario. Finalmente, la membrana estará lista para ser reutilizada (al menos en dos o tres ocasiones más). Hay que tener en cuenta que antes del primer borrado, hay que incubar la membrana con los anticuerpos fosforilados de interés. Después se puede proceder al borrado de la membrana e incubar con los anticuerpos totales, específicos de los anticuerpos fosforilados.We study how to make the protein extract from Western blotting. To do this, two Whatman papers (Extra Thick Blod PAPER Bio-Rad), the use of two sponges and a PVDF membrane are prepared for the transfer of each gel. Everything must be balanced in its transfer buffer before proceeding with the transfer process. These parts shall be soaked for at least 10 minutes in transfer buffer. A voltage of 75 V shall be applied and migrate for 45 minutes under continuous agitation and cooling in the case of 18-well gels (Criterion TGX). The buffer used in the transfer of 18-well gels is Tris Glycine Methanol buffer. The secondary antibody is diluted 1:5,000 to 1:10,000 in 10 % skimmed milk in TTBS solution. The choice of monoclonal or polyclonal secondary antibody always depends on the primary antibody. Finally, the membrane is ready to be reused (at least two or three more times). Before the first blotting, the membrane must be incubated with the phosphorylated antibodies of interest. The membrane can then be blotted and incubated with the total antibodies specific to the phosphorylated antibodies

Extracción de proteínas

El estudio sobre la extracción de proteínas consiste en que, antes de usar, el reactivo A y reactivo B se complementaron con cóctel inhibidor de proteasa 10X (Sigma-Aldrich, P2714), ortovanadato de sodio al 0,5 M al 20 % (S6508, Sigma) y fluoruro de sodio al 0,1 M al 1 % (131675, Panreac). Las mitocondrias aisladas se lisaron en CHAPS al 2 % (C3023, Sigma). Las extracciones citosólicas y mitocondriales se analizaron mediante transferencia Western blotting. El protocolo B debe ser rápido, intentando no sobrepasar 30 segundos. Por otro lado, la adición de 1 μg/ml Leupeptina. 1 μg/ml Pepstatina. 1 μg/ml Aprotinina. 1 μg/ml Benzamidina. El PMSF se diluye en 1 ml de etanol absoluto filtrado. Si hay problemas con el método, probar modificando la concentración de digitonina.The protein extraction study consists of reagent A and reagent B supplemented with 10X protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, P2714), 0,5 M 20 % sodium orthovanadate (S6508, Sigma) and 0,1 M 1 % sodium fluoride (131675, Panreac) before use. Isolated mitochondria were lysed in 2 % CHAPS (C3023, Sigma). Cytosolic and mitochondrial extractions were analysed by Western blotting. Protocol B should be fast, trying not to exceed 30 seconds. On the other hand, the addition of 1 μg/ml Leupeptin. 1 μg/ml Pepstatin. 1 μg/ml Aprotinin. 1 μg/ml Benzamidine. PMSF is diluted in 1 ml of filtered absolute ethanol. If there are problems with the method, try modifying the digitonin concentration

Técnica de silenciamiento génico

Para realizar silenciamiento génico en placas de 6 pocillos (130184, Biolite) se emplean el reactivo HiPerfect Transfection Reagent (509301704, Qiagen); el reactivo Lipofectamine RNAiMAX Transfection (13778150, Invitrogen) y el reactivo Lipofectamine 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen). En los tres procesos se elabora la misma mezcla con siRNA para el control negativo (scrambled) en paralelo. A las 24 horas de incubación con cualquiera de los reactivos se cambia el medio a la placa y se añade medio normal con antibiótico. Con el primer reactivo, pasadas otras 24 horas se añade el tratamiento de interés y se procede al lisado para realizar la técnica de Western blotting. Con el segundo reactivo, tras las 24 horas y el tratamiento adecuado, se procede a fijar la placa con PFA. Con el tercer reactivo, se dejan pasar 24 horas, se aplica el tratamiento previsto y se pasa a la recogida de células y posterior lisado.For gene silencing in 6-well plates (130184, Biolite), HiPerfect Transfection Reagent (509301704, Qiagen); Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent (13778150, Invitrogen) and Lipofectamine 2000 Reagent (11668-019, Invitrogen) are used. In all three processes, the same mixture with siRNA for the negative control (scrambled) is prepared in parallel. After 24 hours of incubation with any of the reagents, the medium is changed to the plate and normal medium with antibiotic is added. With the first reagent, after another 24 hours, the treatment of interest is added and the lysate is lysed for Western blotting. With the second reagent, after 24 hours and the appropriate treatment, the plate is fixed with PFA. With the third reagent, 24 hours are allowed to elapse, the expected treatment is applied and the cells are collected and subsequently lysed

Cultivos celulares

Se utilizan diferentes modelos celulares para validar los resultados en todas las líneas según la procedencia de la línea celular. Los siguientes protocolos se realizan en células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y), fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), células de astrocitoma (U251), células de neuroglioma (H4), fibroblastos humanos (FH) y células de osteosarcoma (U2OS). El modelo celular basado SH-SY5Y nos permitirá realizar una buena aproximación a los mecanismos que medían la muerte celular en células nerviosas. Estas células son ampliamente utilizadas en estudios de neurodegeneración, incluyendo estudios de modelos in vitro de la Enfermedad de Parkinson. Así también el modelo de las células U251 nos permitirán realizar el estudio en unas condicionas más fisiológicas de las células de la glía y así aproximarnos a la interacción de estas células con las células nerviosasDifferent cell models are used to validate the results in all lines depending on the origin of the cell line. The following protocols are performed on human neuroblastoma cells (SH-SY5Y), mouse embryonic fibroblasts (MEF), astrocytoma cells (U251), neuroglioma cells (H4), human fibroblasts (FH) and osteosarcoma cells (U2OS). The SH-SY5Y-based cell model will allow us to make a good approximation of the mechanisms that mediate cell death in nerve cells. These cells are widely used in neurodegeneration studies, including studies of in vitro models of Parkinson's disease. The U251 cell model will also allow us to study glial cells under more physiological conditions and thus approach the interaction of these cells with nerve cells

Técnica de sobreexpresión génica

Para la introducción de proteínas exógenas marcadas (plásmidos bacterianos en ocasiones marcados) se realiza una transfección, que consiste en la introducción de ADN o ARN de un virus o bacteriófago procariota en el interior celular. Después, se realiza una transfección química. Finalmente, se observan las células al microscopio de fluorescencia y si la transfección presenta una buena eficiencia. 24 horas más tarde, se realiza el tratamiento en medio completo, se fijan (placa de 24 o 96 pocillos) y se montan las lamelas (placa 24 pocillos) para su observación si se va a realizar la técnica de inmunofluorescencia o se lisan (placa 6 pocillos) si se va a realizar análisis de la sobreexpresión por Western blotting.For the introduction of tagged exogenous proteins (sometimes tagged bacterial plasmids), a transfection is performed, which involves the introduction of DNA or RNA from a prokaryotic virus or bacteriophage into the cell interior. This is followed by chemical transfection. Finally, the cells are observed under a fluorescence microscope to determine whether the transfection is efficient. 24 hours later, the cells are treated in complete medium, fixed (24- or 96-well plate) and lamellae are mounted (24-well plate) for observation if immunofluorescence is to be performed or lysed (6-well plate) if overexpression analysis by Western blotting is to be performed

Biological effects of olive oil phenolic compounds on mitochondria

Phenolic compounds derived from olive oil have beneficial health properties against cancer, neurodegenerative, and metabolic diseases. Therefore, there are discrepancies in their impact on mitochondrial function that result in changes in oxidative capacity, mitochondrial respiration, and energetic demands. This review focuses on the versatile role of oleuropein, a potent antioxidant that regulates the AMPK/SIRT1/mTOR pathway to modulate autophagy/mitophagy and maintain metabolic homeostasis

X chromosome inactivation does not necessarily determine the severity of the phenotype in Rett syndrome patients

Rett syndrome (RTT) is a severe neurological disorder usually caused by mutations in the MECP2 gene. Since the MECP2 gene is located on the X chromosome, X chromosome inactivation (XCI) could play a role in the wide range of phenotypic variation of RTT patients; however, classical methylation-based protocols to evaluate XCI could not determine whether the preferentially inactivated X chromosome carried the mutant or the wild-type allele. Therefore, we developed an allele-specific methylation-based assay to evaluate methylation at the loci of several recurrent MECP2 mutations. We analyzed the XCI patterns in the blood of 174 RTT patients, but we did not find a clear correlation between XCI and the clinical presentation. We also compared XCI in blood and brain cortex samples of two patients and found differences between XCI patterns in these tissues. However, RTT mainly being a neurological disease complicates the establishment of a correlation between the XCI in blood and the clinical presentation of the patients. Furthermore, we analyzed MECP2 transcript levels and found differences from the expected levels according to XCI. Many factors other than XCI could affect the RTT phenotype, which in combination could influence the clinical presentation of RTT patients to a greater extent than slight variations in the XCI pattern