Modélisation fonctionnelle de la synapse intégrant cellules souches pluripotentes humaines et optogénétique : application à l’étude des neurotoxines botuliques

Botulinum neurotoxins (BoNTs), produced by a bacterium Clostridium botulinum, are among the most toxic substances known. By inhibiting neurotransmitter release at the neuromuscular junction (NMJ), exposure to these neurotoxins results in the fatal flaccid muscular paralysis called botulism. Due to neurotoxins' high potency (lethal dose in Humans: 0.1-1 ng/Kg in intravenous and 1 µg/Kg orally), they became valuable drugs for therapeutic and aesthetic applications, ranging from the treatment of neuromuscular disorders to the reduction of facial wrinkles. Since their first use, the number of indications for these molecules has been steadily increasing over the past decade. A better understanding of their mechanisms of action combined with the emergence of platforms for custom recombinant BoNTs development start to offer new perspectives in term of therapeutic applications. However, such developments are dependent of functional cell-based assays to accurately and robustly evaluate the potential of these neurotoxins. By combining human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with optical technologies such as optogenetics and calcium imaging, my thesis project aimed at establishing two functional human synaptic systems: humanized models for neuromuscular synapse and cortical-cortical synapse. These functional models allowed to study the effect of different variants of BoNTs and to compare their potency in a human physiological context. Such in vitro systems represent a major asset to improve the translational value of preclinical BoNTs dataLes neurotoxines botuliques (BoNT), produites par une bactérie du genre Clostridium botulinum, sont des endoprotéases inhibant le relargage de neurotransmetteurs au niveau de la jonction neuromusculaire (JNM) ce qui aboutit à une paralysie flasque musculaire fatale, connue sous le nom de botulisme. Bien que les BoNT soient extrêmement toxiques (dose létale estimée chez l'Homme : 0,1-1 ng/Kg en intraveineuse et 1 µg/Kg par voie orale) et responsables du botulisme, leur forte affinité pour les neurones moteurs combinée à leur utilisation à des concentrations adaptées en ont fait des médicaments extrêmement précieux pour des indications à la fois thérapeutiques et esthétiques, allant ainsi du traitement des troubles neuromusculaires à la réduction des rides du visage. Depuis leur première utilisation, le nombre d'indications pour ces molécules est en constante hausse. Les connaissances accrues sur le mécanisme d'action des BoNT combinées à l'émergence de plateforme de production recombinante offrent la possibilité de modifier les BoNT à façon, et de conférer à ces molécules de nouveaux potentiels thérapeutiques. Cependant, ces développements nécessitent l'implémentation de tests cellulaires fonctionnels robustes, permettant de récapituler les différentes étapes du mécanisme d'action des BoNT. Dans ce contexte, mon projet de thèse a évalué la possibilité de combiner le cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines avec les technologies optiques telles que l'optogénétique et l'imagerie calcique, pour mettre en place deux systèmes synaptiques humains fonctionnels : un modèle de synapse neuromusculaire et un modèle de synapse cortico-corticale. Ces modèles fonctionnels ont permis d'étudier l'effet de différents variants de BoNT et de comparer leur efficacité dans un contexte physiologique humains. De tels systèmes in vitro représentent un atout majeur pour améliorer la valeur translationnelle des données précliniques sur les BoNT

Functional modeling of the synapse integrating human pluripotent stem cells and optogenetics : application to the study of botulinum neurotoxins

Les neurotoxines botuliques (BoNT), produites par une bactérie du genre Clostridium botulinum, sont des endoprotéases inhibant le relargage de neurotransmetteurs au niveau de la jonction neuromusculaire (JNM) ce qui aboutit à une paralysie flasque musculaire fatale, connue sous le nom de botulisme. Bien que les BoNT soient extrêmement toxiques (dose létale estimée chez l'Homme : 0,1-1 ng/Kg en intraveineuse et 1 µg/Kg par voie orale) et responsables du botulisme, leur forte affinité pour les neurones moteurs combinée à leur utilisation à des concentrations adaptées en ont fait des médicaments extrêmement précieux pour des indications à la fois thérapeutiques et esthétiques, allant ainsi du traitement des troubles neuromusculaires à la réduction des rides du visage. Depuis leur première utilisation, le nombre d'indications pour ces molécules est en constante hausse. Les connaissances accrues sur le mécanisme d'action des BoNT combinées à l'émergence de plateforme de production recombinante offrent la possibilité de modifier les BoNT à façon, et de conférer à ces molécules de nouveaux potentiels thérapeutiques. Cependant, ces développements nécessitent l'implémentation de tests cellulaires fonctionnels robustes, permettant de récapituler les différentes étapes du mécanisme d'action des BoNT. Dans ce contexte, mon projet de thèse a évalué la possibilité de combiner le cellules souches pluripotentes induites (CSPi) humaines avec les technologies optiques telles que l'optogénétique et l'imagerie calcique, pour mettre en place deux systèmes synaptiques humains fonctionnels : un modèle de synapse neuromusculaire et un modèle de synapse cortico-corticale. Ces modèles fonctionnels ont permis d'étudier l'effet de différents variants de BoNT et de comparer leur efficacité dans un contexte physiologique humains. De tels systèmes in vitro représentent un atout majeur pour améliorer la valeur translationnelle des données précliniques sur les BoNT.Botulinum neurotoxins (BoNTs), produced by a bacterium Clostridium botulinum, are among the most toxic substances known. By inhibiting neurotransmitter release at the neuromuscular junction (NMJ), exposure to these neurotoxins results in the fatal flaccid muscular paralysis called botulism. Due to neurotoxins' high potency (lethal dose in Humans: 0.1-1 ng/Kg in intravenous and 1 µg/Kg orally), they became valuable drugs for therapeutic and aesthetic applications, ranging from the treatment of neuromuscular disorders to the reduction of facial wrinkles. Since their first use, the number of indications for these molecules has been steadily increasing over the past decade. A better understanding of their mechanisms of action combined with the emergence of platforms for custom recombinant BoNTs development start to offer new perspectives in term of therapeutic applications. However, such developments are dependent of functional cell-based assays to accurately and robustly evaluate the potential of these neurotoxins. By combining human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with optical technologies such as optogenetics and calcium imaging, my thesis project aimed at establishing two functional human synaptic systems: humanized models for neuromuscular synapse and cortical-cortical synapse. These functional models allowed to study the effect of different variants of BoNTs and to compare their potency in a human physiological context. Such in vitro systems represent a major asset to improve the translational value of preclinical BoNTs dat

Emerging Opportunities in Human Pluripotent Stem-Cells Based Assays to Explore the Diversity of Botulinum Neurotoxins as Future Therapeutics

Botulinum neurotoxins (BoNTs) are produced by Clostridium botulinum and are responsible for botulism, a fatal disorder of the nervous system mostly induced by food poisoning. Despite being one of the most potent families of poisonous substances, BoNTs are used for both aesthetic and therapeutic indications from cosmetic reduction of wrinkles to treatment of movement disorders. The increasing understanding of the biology of BoNTs and the availability of distinct toxin serotypes and subtypes offer the prospect of expanding the range of indications for these toxins. Engineering of BoNTs is considered to provide a new avenue for improving safety and clinical benefit from these neurotoxins. Robust, high-throughput, and cost-effective assays for BoNTs activity, yet highly relevant to the human physiology, have become indispensable for a successful translation of engineered BoNTs to the clinic. This review presents an emerging family of cell-based assays that take advantage of newly developed human pluripotent stem cells and neuronal function analyses technologies

Optogenetically controlled human functional motor endplate for testing botulinum neurotoxins

International audienceAbstract Background The lack of physiologically relevant and predictive cell-based assays is one of the major obstacles for testing and developing botulinum neurotoxins (BoNTs) therapeutics. Human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs)-derivatives now offer the opportunity to improve the relevance of cellular models and thus the translational value of preclinical data. Methods We investigated the potential of hiPSC-derived motor neurons (hMNs) optical stimulation combined with calcium imaging in cocultured muscle cells activity to investigate BoNT-sensitivity of an in vitro model of human muscle-nerve system. Results Functional muscle-nerve coculture system was developed using hMNs and human immortalized skeletal muscle cells. Our results demonstrated that hMNs can innervate myotubes and induce contractions and calcium transient in muscle cells, generating an in vitro human motor endplate showing dose-dependent sensitivity to BoNTs intoxication. The implementation of optogenetics combined with live calcium imaging allows to monitor the impact of BoNTs intoxication on synaptic transmission in human motor endplate model. Conclusions Altogether, our findings demonstrate the promise of optogenetically hiPSC-derived controlled muscle-nerve system for pharmaceutical BoNTs testing and development

MBNL‐dependent impaired development within the neuromuscular system in myotonic dystrophy type 1

International audienc