Η ρύθμιση των microRNAs κατά την ενεργοποίηση των μακροφάγων

Endotoxin tolerance occurs to protect the organism from hyperactivation of innate immune responses, primarily mediated by macrophages. Regulation of endotoxin tolerance occurs at multiple levels of cell responses and requires significant changes in gene expression. During macrophage activation, induced expression of miR-155 and miR-146a contributes to the regulation of the inflammatory response and endotoxin tolerance. Herein, we demonstrate that expression of both miRNAs is co-ordinately regulated during endotoxin tolerance by a complex mechanism involving mono-allelic inter-chromosomal association, alterations in histone methyl marks and transcription factor binding. Upon activation of naïve macrophages, Histone3 was tri-methylated at lysine4 (H3K4me3) and NFBp65 was bound on both miR-155 and miR-146a gene loci. However, at the stage of endotoxin tolerance both miR gene loci were occupied by C/EBPβ, NFBp50 and the repressive Histone3 marks H3K9me3. DNA fluorescence in situ hybridization (DNA-FISH) experiments revealed mono-allelic inter-chromosomal co-localization of miR-155 and miR-146a gene loci at the stage of endotoxin tolerance, while RNA-DNA-FISH experiments showed that the co-localized alleles were silenced, suggesting a common repressive mechanism. Genetic ablation of Akt1, which is known to abrogate endotoxin tolerance, abolished induction of loci co-localization and C/EBPβ binding, further supporting that this mechanism occurs specifically in endotoxin tolerance. This thesis demonstrates that two miRNAs are co-ordinately regulated via gene co-localization at the three dimensional chromatin space, similar transcriptional machinery and Histone3 methylation profile, contributing to the development of endotoxin tolerance. Further insight into the role of AKT in regulation of M1/M2 polarization, revealed the essential role of these microRNAs in macrophage phenotype. Akt1 ablation promotes miR-155 expression in LPS-stimulated macrophage. Measuring miR-155 in Akt2-depleted macrophages revealed that Akt2 ablation had the opposite effect, reducing miR-155 expression in both resting and LPS-activated macrophages. Therefore, down-regulation of miR-155 in Akt2-defiecient macrophages results in up-regulation of its target C/EBPβ and, consequently, in the induction of Arg1, a hallmark of M2 macrophage polarization. Akt2 deficiency resulted, however, in a significant upregulation of miR-146a, which mediates M1 phenotype suppression and assure endotoxin tolerance. miR-146a transfection in WT macrophages was able to inhibit iNOS induction while miR-146a suppression in Akt2-depleted mice resulted in upregulation of iNOS expression. The physiological and clinical significance of these miRs in sepsis was supported by further data in humans. Critically ill patients with impaired immune responses (CARS syndrome) are associated with increased miR-155 and miR-146 expression. In vivo transferring of these miRs by using amphoteric liposomes seems to be highly promising, underlining miR-155 and miR-146 as potential novel molecular biomarkers of macrophage sensitivity and CARS syndrome and tools for therapeutic purposes.Η ανοσολογική ανοχή είναι απαραίτητη για την προστασία του οργανισμού από την υπερ-ενεργοποίηση της ανοσολογικής απόκρισης και διαμεσολαβείται κυρίως μέσω μακροφάγων. Η ρύθμιση της ανοσολογικής ανοχής συντελείται σε πολλαπλά επίπεδα και απαιτεί σημαντικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Κατά τη διαδικασία της ενεργοποίησης των μακροφάγων, η επαγόμενη έκφραση του miR-155 και miR-146a συμβάλλει στη ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης και της ανοσολογικής ανοχής. Στην παρούσα διατριβή, αποδεικνύεται ότι η έκφραση και των δύο miRNAs συν-ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της ανοσολογικής ανοχής μέσω ενός πολύπλοκου μηχανισμού που περιλαμβάνει χρωμοσωμικές αλληλεπιδράσεις, μεταβολές στο πρότυπο μεθυλίωσης των ιστονών και μεταβολές στην πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων. Κατά την ενεργοποίηση των μακροφάγων, παρατηρείται τρι-μεθυλίωση της λυσίνης 4 στην ιστόνη H3 (H3K4me3) και πρόσδεση του NFBp65 στους υποκινητές των γονιδίων miR-155 και miR-146a. Ωστόσο, κατά το στάδιο της ανοσολογικής ανοχής παρατηρείται τρι-μεθυλίωση της ιστόνης Η3 στην λυσίνη 9 (H3K9me3) και πρόσδεση των μεταγραφικών παραγόντων C/ΕΒΡβ και NFBp50.DNA-FISH πειράματα αποκάλυψαν την αλληλεπίδραση των γονιδιακών τόπων του miR-155 και miR-146a στο ένα αλλήλιο, στο στάδιο της ανοσολογικής ανοχής, ενώ πειράματα RNA-DNA-FISH έδειξαν ότι όταν αυτοί οι γονιδιακοί τόποι συνεντοπίζονται, δεν παρατηρείται μεταγραφή των γονιδίων τους, αποδεικνύοντας έναν κοινό μηχανισμό σίγησης. Στην περίπτωση των AKT1-/- ποντικών, στα οποία καταργείται το φαινόμενο της ανοσολογικής ανοχής, δεν παρατηρείται συνεντοπισμός των γονιδιακών τόπων, υποστηρίζοντας περαιτέρω ότι αυτός ο μηχανισμός συμβαίνει ειδικά κατά το στάδιο της ανοχής των μακροφάγων. Επομένως, δύο miRNAs συν-ρυθμίζονται μέσω αλληλεπίδρασης των γονιδιακών τους τόπων, μέσω κοινών μεταγραφικών παραγόντων και παρόμοιου προφίλ μεθυλίωσης της ιστόνης Η3, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη της ανοσολογικής ανοχής. Επιπλέον, η ανάλυση του ρόλου της ΑΚΤ κινάσης στα διάφορα στάδια ενεργοποίησης των μακροφάγων και στον M1 / M2 φαινότυπο ανέδειξε τη σημαντική συμβολή αυτών των microRNAs. Η απαλοιφή του γονιδίου Akt1 προήγαγε την έκφραση του miR-155 στα LPS-διεγερμένα μακροφάγα. Η μέτρηση των επιπέδων του miR-155 σε Akt2 - / - μακροφάγα αποκάλυψε το αντίθετο αποτέλεσμα. Ως εκ τούτου, η μείωση της έκφρασης του miR-155 στα Akt2 - / - μακροφάγα είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή του στόχου του, του C/ΕΒΡβ και, κατά συνέπεια, την επαγωγή της Arg1, πρωτείνης που εκφράζεται στον Μ2 φαινότυπο. Αντιστοίχως, η απαλοιφή της Akt2 οδήγησε σε σημαντική αύξηση της έκφρασης του miR-146a, το οποίο παίζει κρίσιμο ρόλο στην καταστολή του φαινοτύπου M1 και στην εξασφάλιση της ανοσολογικής ανοχής. Η επαγωγή του miR-146a σε WT μακροφάγα ήταν ικανή να αναστείλει την επαγωγή της iNOS ενώ η καταστολή του miR-146a σε Akt2 - / - μακροφάγα είχε σαν αποτέλεσμα της αύξηση της έκφρασης της iNOS. Η κλινική σημασία των ευρημάτων αυτών στη σήψη και την ανοσολογική ανοχή υποστηρίχθηκε από περαιτέρω πειραματικά δεδομένα σε ανθώπινα δείγματα. Σε βαρέως πάσχοντες ασθενείς με μειωμένη ανοσολογική απόκριση (σύνδρομο CARS), όπως αυτή χαρακτηρίζεται από τη μειωμένη ανταπόκριση –παραγωγή κυτταροκινών στο πλάσμα έπειτα απο την ex vivo επώαση του περιφερικού αίματος με LPS, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του miR-155 και miR-146. Η in vivo μεταφορά αυτών των Mirs με τη βοήθεια λιποσωμάτων ήταν ο επόμενος στόχος που επετεύχθη, πράγμα που καθιστά αυτά τα δύο Mirs πιθανούς μοριακούς δείκτες του συνδρόμου CARS και εργαλεία για θεραπευτικούς σκοπούς

Neorogioltriol and Related Diterpenes from the Red Alga <i>Laurencia</i> Inhibit Inflammatory Bowel Disease in Mice by Suppressing M1 and Promoting M2-Like Macrophage Responses

Macrophages are central mediators of inflammation, orchestrating the inflammatory response through the production of cytokines and nitric oxide. Macrophages obtain pro-inflammatory (M1) and anti-inflammatory (M2) phenotypes, which can be modulated by soluble factors, including natural products. Despite the crucial protective role of inflammation, chronic or deregulated inflammation can lead to pathological states, such as autoimmune diseases, metabolic disorders, cardiovascular diseases, and cancer. In this case, we studied the anti-inflammatory activity of neorogioltriol (1) in depth and identified two structurally related diterpenes, neorogioldiol (2), and O11,15-cyclo-14-bromo-14,15-dihydrorogiol-3,11-diol (3), with equally potent activity. We investigated the mechanism of action of metabolites 1&#8315;3 and found that all three suppressed macrophage activation and promoted an M2-like anti-inflammatory phenotype by inducing expression of Arginase1, MRC1, IRAK-M, the transcription factor C/EBP&#946;, and the miRNA miR-146a. In addition, they suppressed iNOS induction and nitric oxide production. Importantly, treatment of mice with 2 or 3 suppressed DSS-induced colitis by reducing tissue damage and pro-inflammatory cytokine production. Thus, all these three diterpenes are promising lead molecules for the development of anti-inflammatory agents targeting macrophage polarization mechanisms

The Downregulation of GFI1 by the EZH2-NDY1/KDM2B-JARID2 Axis and by Human Cytomegalovirus (HCMV) Associated Factors Allows the Activation of the HCMV Major IE Promoter and the Transition to Productive Infection

<div><p>Earlier studies had suggested that epigenetic mechanisms play an important role in the control of human cytomegalovirus (HCMV) infection. Here we show that productive HCMV infection is indeed under the control of histone H3K27 trimethylation. The histone H3K27 methyltransferase EZH2, and its regulators JARID2 and NDY1/KDM2B repress GFI1, a transcriptional repressor of the major immediate-early promoter (MIEP) of HCMV. Knocking down EZH2, NDY1/KDM2B or JARID2 relieves the repression and results in the upregulation of GFI1. During infection, the incoming HCMV rapidly downregulates the GFI1 mRNA and protein in both wild-type cells and in cells in which EZH2, NDY1/KDM2B or JARID2 were knocked down. However, since the pre-infection levels of GFI1 in the latter cells are significantly higher, the virus fails to downregulate it to levels permissive for MIEP activation and viral infection. Following the EZH2-NDY1/KDM2B-JARID2-independent downregulation of GFI1 in the early stages of infection, the virus also initiates an EZH2-NDY1/ΚDM2Β-JARID2-dependent program that represses GFI1 throughout the infection cycle. The EZH2 knockdown also delays histone H3K27 trimethylation in the immediate early region of HCMV, which is accompanied by a drop in H3K4 trimethylation that may contribute to the shEZH2-mediated repression of the major immediate early HCMV promoter. These data show that HCMV uses multiple mechanisms to allow the activation of the HCMV MIEP and to prevent cellular mechanisms from blocking the HCMV replication program.</p></div

NDY1/KDM2B, EZH2 and H3K27 tri-methylation are required for immediate-early gene transcription.

<p><b>A and B</b>. HFFs were lentivirally or retrovirally transduced with the indicated constructs and they were subsequently infected with HCMV (MOI 0.5). The cells were fixed 5 hours later and the percentage of IE1-expressing cells was measured by FACS analysis. The bars show the percentage of IE1-positive cells (mean ± SD). <b>C</b>. Comparison of IE1 expression in HCMV-infected HFFs, transduced with pLKO.1, pLKO.1-shEZH2 or pLKO.1-shNDY1/KDM2B, prior to the infection. Cells were infected with HCMV (MOI 0.5). Western blots of cell lysates harvested at the indicated time points, were probed with anti-IE1 or anti-actin (loading control) antibodies. <b>D</b>. HFFs were infected with HCMV (MOI 0.5 PFU/cell) before and after a 30 minute pretreatment with the EZH2 inhibitor DZNep. The Western blotting shows the expression of EZH2 and IE1 in untreated and DZNep-pretreated cells at 24 hours from the start of the infection. <b>E</b>. HFFs were infected with HCMV (MOI 0.5 PFU/cell) before and after a 30-minute pretreatment with the EZH2 inhibitor DZNep. The infected cells were monitored by light microscopy 5 days later. In addition, they were stained for IE1 and counterstained with DAPI at 5 hours post-infection, and they were analyzed by epifluoerescence microscopy. Bar = 100 µm. <b>F</b>. The progeny virus harvested from the DZNep-treated and untreated cells as in D, 5 days after infection, was titrated by standard viral plaque assays. The bars show the viral titers (mean ± SD).</p

Lentiviral and retroviral constructs used.

<p>Lentiviral and retroviral constructs used.</p

Primer sets used in Real-Time PCR.

<p>Primer sets used in Real-Time PCR.</p

Primers set used for ChIP analysis.

<p>Primers set used for ChIP analysis.</p