Mesenchymal Stem Cell Graft Improves Recovery after Spinal Cord Injury in Adult Rats through Neurotrophic and Pro-Angiogenic Actions

Numerous strategies have been managed to improve functional recovery after spinal cord injury (SCI) but an optimal strategy doesn't exist yet. Actually, it is the complexity of the injured spinal cord pathophysiology that begets the multifactorial approaches assessed to favour tissue protection, axonal regrowth and functional recovery. In this context, it appears that mesenchymal stem cells (MSCs) could take an interesting part. The aim of this study is to graft MSCs after a spinal cord compression injury in adult rat to assess their effect on functional recovery and to highlight their mechanisms of action. We found that in intravenously grafted animals, MSCs induce, as early as 1 week after the graft, an improvement of their open field and grid navigation scores compared to control animals. At the histological analysis of their dissected spinal cord, no MSCs were found within the host despite their BrdU labelling performed before the graft, whatever the delay observed: 7, 14 or 21 days. However, a cytokine array performed on spinal cord extracts 3 days after MSC graft reveals a significant increase of NGF expression in the injured tissue. Also, a significant tissue sparing effect of MSC graft was observed. Finally, we also show that MSCs promote vascularisation, as the density of blood vessels within the lesioned area was higher in grafted rats. In conclusion, we bring here some new evidences that MSCs most likely act throughout their secretions and not via their own integration/differentiation within the host tissue

Le milieu conditionné de cellules souches mésenchymateuses: une alternative prometteuse à la transplantation de cellules souches mésenchymateuses après lésion de la moelle épinière

Les lésions de la moelle épinière engendrent des pertes de fonctions motrices et sensorielles plus ou moins importantes selon le niveau médullaire atteint et la gravité de la lésion. On estime à 2,5 millions le nombre de personnes atteintes de lésions de la moelle épinière dans le monde. Ces patients, souvent lourdement handicapés, sont généralement jeunes. La problématique principale du traumatisme médullaire est qu'il évolue défavorablement au cours du temps. Les lésions qui en résultent appelées « lésions secondaires » sont caractérisées par divers phénomènes tels qu'une inflammation, le développement d'une cicatrice astrogliale dense et la formation de cavités kystiques correspondant à du tissu nécrosé. Ces processus dégénératifs mènent à l'établissement d'un environnement lésionnel inhibiteur pour la régénération axonale et pour la récupération fonctionnelle.De nombreuses stratégies expérimentales visant à réparer les tissus médullaires endommagés ont été étudiées. Parmi elles, l'utilisation de cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse constitue une solution prometteuse. En effet, ces cellules possèdent d'intéressantes propriétés permettant de moduler l'environnement lésionnel et ainsi favoriser la régénération des axones et la récupération fonctionnelle. Malheureusement, la survie de ces cellules et leur différenciation une fois transplantées dans le tissu hôte sont médiocres. De plus, il a été démontré, dans d'autres contextes pathologiques, que ces cellules pouvaient induire des effets néfastes une fois greffées. Cependant, les cellules souches mésenchymateuses sont connues pour sécréter une grande quantité de facteurs divers et il a été proposé que l'action paracrine de ces cellules puisse être à l'origine des effets bénéfiques observés après leur transplantation au sein du tissu médullaire lésé. Nous avons donc décidé d'administrer les facteurs sécrétés par ces cellules à des rats ayant subi une lésion de la moelle épinière par contusion et d'étudier, en parallèle, leurs propriétés in vitro. Nous montrons, in vivo, que le milieu conditionné par les cellules souches mésenchymateuses (MC-CSM) contenant les facteurs sécrétés par ces dernières, administré au niveau de la lésion, favorise la récupération locomotrice des animaux. Les analyses histologiques révèlent une action pro-angiogénique du MC-CSM ainsi qu'un effet de protection tissulaire. Le traitement n'a par contre pas d'effet sur la repousse axonale, l'inflammation et le développement de la cicatrice astrogliale. In vitro, le MC-CSM permet de protéger les neurones contre l'apoptose, active les macrophages et favorise l'angiogenèse. Finalement, la caractérisation du MC-CSM par détection protéique multiple et ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) a permis d'identifier divers facteurs trophiques ainsi que des cytokines probablement impliqués dans les effets observés. En conclusion, nos résultats confirment le mode d'action paracrine des cellules souches mésenchymateuses et les effets bénéfiques de ces facteurs dans le contexte des lésions médullaires. Ceci ouvre la porte à la possibilité de développer une approche thérapeutique basée sur l'utilisation d'un milieu acellulaire permettant d'éviter les éventuelles conséquences néfastes décrites dans d'autres modèles après greffe de cellules

Impact model of spinal cord injury

peer reviewe

Neuroprotection.

<p>MSC transplants favor tissue sparing after SCI. Luxol fast blue/hematoxylin staining on cross sections of MSC-grafted (<b>A</b>) and control injured only (<b>B</b>) rats, 21 days after transplantation. The quantification of spared tissue (<b>C</b>), as assessed by the mean ratio of injured area on total area of the sections, reveals a significant decrease of the lesion extension in MSC treated rats compared to control ones. * p<0.05.</p

Applikations- und Kontaktkräfte bei Steigbügelprothesen

Einleitung: Je nach Prothesentyp werden bei der Applikation vergleichsweise hohe Kräfte auf den Mittelohrapparat aufgebracht. Auch die für den Schalltransfer entscheidenden Kontaktkräfte variieren sehr stark. Das Kraftniveau bei der Applikation spiegelt nicht unbedingt die Güte der Verbindung zum langen Ambossfortsatz wider. Wichtige Aspekte bei der Bewertung eines Prothesentyps sind das standardisierte Einsetzen der Prothese, der reproduzierbare Sitz und das sichere Handling auch für weniger erfahrene Operateure.Methoden: Es wurden unterschiedliche Stapesprothesen (z.B. Bucket-, Clip- und Crimp-Prothesen) hinsichtlich der Applikations- und Kontaktkräfte experimentell untersucht. Diese wurden von verschiedenen Operateuren an einem technischen Modell des Amboss appliziert und der räumliche Kraftvektor bei der Applikation wurde erfasst. Die Kontaktkraft zwischen Prothese und Ambossschenkel wurde separat mittels einer Kraftmessdose und eines Laser-Doppler-Vibrometers gemessen. Ergebnisse: Bei der Applikation sind die absoluten Kraftwerte und die Streubreite abhängig vom Prothesentyp und dem Trainingszustand des Operateurs. Gegenüber den Clip-Prothesen, insbesondere solchen aus superelastischem Material, treten bei Crimp-Prothesen hohe Werte auf. Die Clip-Prothesen zeigen eine gute Reproduzierbarkeit mit vergleichsweise geringer Streuung. Konstruktionsbedingt hängt die Applikationskraft bei diesem Prothesentyp direkt mit der Kontaktkraft zusammen. Schlussfolgerung: Insbesondere beim Crimpen ist die Applikationskraft nur schwer kontrollierbar. Dabei kann eine Schädigung des Mittelohrapparats nicht ausgeschlossen werden. Die zur Schallübertragung notwendige Kontaktkraft wird meist ereicht, wobei übermäßig große Kontaktkräfte Nekrosen hervorrufen können.Der Erstautor gibt keinen Interessenkonflikt an

Behavioral analysis.

<p>(<b>A</b>) Locomotor scores as assessed by the BBB rating scale. MSC grafted rats reach significantly higher scores compared to both control groups. Only MSC transplanted rats reach the weight-supporting step level (score of 9). Injured + MSC vs injured only p = 0.0029; injured + MSC vs injured + vehicle p<0.0001. (<b>B</b>) Grid test scores assessing deficits in descending fine motor control. MSC grafted rats reach higher scores, significantly different from control rats. Injured + MSC vs injured only p<0.0001; injured + MSC vs injured + vehicle p<0.0001.</p

Blood vessel quantification.

<p>(<b>A</b>–<b>B</b>) RECA-1 immunohistological staining on longitudinal sections of MSC-treated (<b>A</b>) and control vehicle-treated (<b>B</b>) spinal cords. Scale bar: 500 µm. (<b>C</b>) Blood vessel quantification within the lesioned site reveals a significant increase in MSC treated rats compared to control-vehicle treated ones. *p<0.05.</p

Mesenchymal stem cell characterization.

<p>(<b>A</b>): Phase contrast microphotography of rat MSCs in culture. Cells exhibit typical elongated, fibroblast-like morphology (arrowheads) or large, flattened shape (asterisks). (<b>B</b>) CD90 and (<b>C</b>) CD271 positive immunofluorescent labelings of P4 MSCs in culture, while CD45 <b>(D)</b> and CD11b (<b>E</b>) immunostainings are negative. (<b>F</b>) Adipogenic differentiation of P4-MSCs revealed with Oil Red O. (<b>G</b>) Alizarin Red staining of P4 MSCs induced to osteocytes reveals mineral deposition. (<b>H</b>) Immunofluorescent visualization of nestin induction in P12-MSCs deprived of serum. Nuclei are labeled with the Vectashield-DAPI mounting medium.</p

Cytokine array and Elisa results.

<p>(<b>A</b>) Cytokine arrays. Spinal cord extracts from injured vehicle-treated (n = 4) and MSC-treated (n = 5) rats. ß-NGF is significantly increased within the lesioned site 3 days after MSC injection compared to controls. * p<0.05 (mean±S.E.). (<b>B</b>) Histogram showing the amounts, in pg/ml, of the neurotrophins NGF and BDNF as quantified by Elisa, within 2 distinct P12 MSC-conditioned media (M1 and M2). (<b>C</b>) NGF and (<b>D</b>) BDNF fluorescent immunocytochemistry on P12 MSCs <i>in vitro</i>. Scale bar : 50 µm.</p

Axonal regrowth.

<p>(<b>A</b>–<b>B</b>) GAP43 immunoreactivity on transversal spinal cord sections, 28 days after SCI, in injured + MSC (A) and injured-only (B) groups. Sections were taken at the lesion site. (<b>C</b>) Image analysis doesn't show a significant difference (Student's t-Test, p = 0,23) in the percentage of total lesioned area immunoreactive for GAP43 between treated (2,96 ± 0,35 %) and control (2,25 ± 0,44 %) groups</p