Stéatose hépatique non alcoolique : implication du stress de réplication dans la progression de la maladie

The prevalence of non-alcoholic-fatty-liver disease (NAFLD) is increasing in industrial countries. NAFLD is characterized by hepatic steatosis associated with chronic substrate overload resulting in lipotoxicity: an important mechanism leading to steatohepatitis (NASH). Chronic hepatocyte cell death and compensatory proliferation during NASH with mild/advanced fibrosis and immune response contribute to increased hepatocellular carcinoma risk. We previously demonstrated using mouse models of NAFLD that dividing fatty hepatocytes activate the DNA Damage Response, which precludes the activation of the mitotic kinase (CDK1-cyclinB) and leads to endoreplication. Interestingly, endoreplication is considered as an alternative division program (without mitosis) in a context of genomic stress. The goal of my PhD was to determine DNA damage stigmata inducing the DDR in fatty hepatocytes and the outcome in terms of disease progression. Using different mouse models of NAFLD (High-Fat-High-Sucrose and Choline-Deficient/High-Fat diets), we showed by transcriptomic analysis that replicating fatty hepatocytes harbored an enriched gene set involved in G2/M checkpoint associated to DNA repair. DNA combing and Comet assay show that NAFLD hepatocytes harbor Replication Stress (RS). In fact, we observed a reduction in replication speed with the presence of stalled fork. Regarding the presence of DNA breaks, replicating NAFLD hepatocytes display high levels of gammaH2AX with a pan-nuclear pattern staining. Molecular analyses reveal a selected activation of p-ATR/p-RPAS33, specific for single-strand-DNA Breaks. Interestingly, only dividing NASH hepatocytes present double-strand breaks DNA (53BP1 labeling). Liquid Chromatography combined with Mass Spectrometry analyses reveal that nucleotides and dNTP pools are imbalanced during fatty hepatocyte division. Importantly, dNTPs medium-supplementation partially rescued the RS. We finally demonstrated that single-stranded DNA fragments are released in the cytosol of damaged fatty hepatocytes, and induce the activation of the cGAS-cGAMP-STING pathway leading to a pro-inflammatory type I interferon response. Importantly, we recently observed the same signaling in human NASH hepatocytes associated to DNA damage. Altogether, my PhD shed new light on the mechanism by which dividing fatty hepatocytes might promote NASH progression.La prévalence de la stéatose hépatique non-alcoolique (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease - NAFLD, en anglais) est en augmentation constante dans les pays industrialisés. La NAFLD se caractérise par une stéatose hépatique associée à une surcharge chronique d'acides gras, qui entraîne une lipotoxicité. Celle-ci est considérée comme un des « hits » majeurs conduisant à la stéatohépatite (NASH). Les hépatocytes effectuent des cycles de lyse-régénération induits suite à une mort chronique suivit d'une prolifération compensatoire. Ces cycles, associés à une fibrose légère/avancée et une réponse immunitaire, contribuent à augmenter le risque de développer un carcinome hépatocellulaire. Le laboratoire a précédemment démontré, à l'aide de modèles murins de NAFLD, que la division des hépatocytes stéatosiques active la réponse aux dommages de l'ADN (DNA Damage Response - DDR, en anglais), ce qui empêche l'activation de la kinase mitotique (CDK1-cycline B) et conduit à un cycle d'endoréplication. Il est intéressant de noter que l'endoreplication est considérée comme un programme de division alternatif (sans mitose) dans un contexte de stress génomique. L'objectif de mon doctorat était de déterminer les stigmates de dommages de l'ADN induisant l'activation du DDR dans les hépatocytes gras et la conséquence sur la progression de la maladie. En utilisant différents modèles murins de NAFLD (High-Fat-High-Sucrose et Choline-Deficient /High-Fat diet), nous avons montré par analyse transcriptomique que la réplication des hépatocytes gras est associée à un ensemble de gènes enrichis dans le point de contrôle G2/M associé à la réparation de l'ADN. Des analyses plus fines par peignage moléculaire et « Comet Assay » montrent que les hépatocytes NAFLD présentent un stress de réplication (SR). Ceux-ci exhibent une réduction de la vitesse de réplication associée à la présence de fourches de réplication à l'arrêt. Concernant la présence de cassures de l'ADN, les hépatocytes NAFLD en cours de réplication affichent des niveaux élevés de gamma-H2AX avec un marquage pan-nucléaire. Des analyses moléculaires révèlent une activation de p-ATR/p-RPAS33, spécifique des cassures de l'ADN associées à la réplication (dit « simple-brin »). Il est intéressant de noter que seuls les hépatocytes CD-HFD en division présentent des cassures d'ADN double-brin (marquage 53BP1). Par chromatographie liquide combinée à de la spectrométrie de masse, nous montrons que les nucléotides et les pools de dNTP sont déséquilibrés lors de la division des hépatocytes gras. La supplémentation en dNTPs suffit à diminuer partiellement le SR. Enfin, nous démontrons que des fragments d'ADN simple-brin sont libérés dans le cytosol des hépatocytes gras endommagés, et induisent l'activation de la voie cGAS-cGAMP-STING menant à une réponse pro-inflammatoire de l'interféron de type I. De façon intéressante, nous avons récemment observé la même signalisation dans les hépatocytes NASH humains, associée à des dommages de l'ADN. Dans l'ensemble, mon doctorat a permis de mettre en évidence le mécanisme par lequel la division des hépatocytes gras peut favoriser la progression du NASH d'un point de vu lésionnel et inflammatoire

La polyploïdie hépatique

La polyploïdie (amplification du génome entier) fait référence à des organismes dont les cellules ont plus de deux jeux complets de chromosomes homologues. La polyploïdie a été observée pour la première fois chez les plantes, il y a plus d'un siècle. Il est dorénavant connu que ce processus se produit chez de nombreux eucaryotes dans diverses circonstances. Chez les mammifères, le développement de cellules polyploïdes peut contribuer à la différenciation des tissus. Il peut donc présenter un gain de fonction. Alternativement, il peut être associé au développement de différentes pathologies comme le cancer. Il existe différents mécanismes qui favorisent la genèse des cellules polyploïdes, dont la fusion cellulaire ou une division cellulaire anormale. Chez les mammifères, la polyploïdie est une des caractéristiques des cellules hépatiques. La polyploïdisation survient en effet principalement au cours du développement du parenchyme hépatique, mais également chez l'adulte, à la suite de différents stress. Des progrès récents ont permis de comprendre les mécanismes de polyploïdisation du tissu hépatique et ses conséquences fonctionnelles dans un contexte physiologique et pathologique

Hepatospecific ablation of p38α MAPK governs liver regeneration through modulation of inflammatory response to CCl4-induced acute injury

International audienceMammalian p38α MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) transduces a variety of extracellular signals that regulate cellular processes, such as inflammation, differentiation, proliferation or apoptosis. In the liver, depending of the physiopathological context, p38α acts as a negative regulator of hepatocyte proliferation as well as a promotor of inflammatory processes. However, its function during an acute injury, in adult liver, remains uncharacterized. In this study, using mice that are deficient in p38α specifically in mature hepatocytes, we unexpectedly found that lack of p38α protected against acute injury induced by CCl4 compound. We demonstrated that the hepatoprotective effect alleviated ROS accumulation and shaped the inflammatory response to promote efficient tissue repair. Mechanistically, we provided strong evidence that Ccl2/Ccl5 chemokines were crucial for a proper hepatoprotective response observed secondary to p38α ablation. Indeed, antibody blockade of Ccl2/Ccl5 was sufficient to abrogate hepatoprotection through a concomitant decrease of both inflammatory cells recruitment and antioxidative response that result ultimately in higher liver damages. Our findings suggest that targeting p38α expression and consequently orientating immune response may represent an attractive approach to favor tissue recovery after acute liver injury