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CaractĂ©risation intĂ©grative et dĂ©veloppement dâoutils molĂ©culaires chez la bactĂ©rie "Mesoplasma florum"
LâĂ©mergence de la biologie synthĂ©tique marque lâentrĂ©e dans une nouvelle Ăšre oĂč il sera possible de modifier et reprogrammer des gĂ©nomes entiers afin de rĂ©pondre Ă des besoins spĂ©cifiques. Ce domaine de recherche est par consĂ©quent appelĂ© Ă jouer un rĂŽle de premier plan dans le dĂ©veloppement de nouvelles technologies visant Ă sâattaquer Ă certains des plus grands dĂ©fis du 21e siĂšcle tels que la multirĂ©sistance aux antibiotiques, la production dâĂ©nergies renouvelables et le traitement de maladies comme le cancer ou le diabĂšte. Notre habiletĂ© actuelle Ă programmer des comportements cellulaires prĂ©visibles est cependant trĂšs limitĂ©e, principalement parce que les organismes modĂšles couramment utilisĂ©s possĂšdent une complexitĂ© qui dĂ©passe nos capacitĂ©s dâanalyse et que les rĂšgles fondamentales qui gouvernent le fonctionnement global des cellules demeurent encore mal comprises.
En raison de leurs gĂ©nomes remarquablement petits, les bactĂ©ries appartenant Ă la classe des Mollicutes reprĂ©sentent des candidats particuliĂšrement intĂ©ressants afin de dĂ©cortiquer le fonctionnement intĂ©gral de cellules via les approches intĂ©gratives de la biologie des systĂšmes et de la gĂ©nomique synthĂ©tique. La majoritĂ© de ces microorganismes sont toutefois caractĂ©risĂ©s par un style de vie parasitaire, des capacitĂ©s mĂ©taboliques rĂ©duites et une croissance relativement lente nĂ©cessitant lâutilisation de milieux de culture complexes. Conjointement au manque dâoutils gĂ©nĂ©tiques efficaces, ces caractĂ©ristiques restreignent considĂ©rablement leur manipulation en laboratoire. Certains Mollicutes se dĂ©marquent nĂ©anmoins en tant quâorganismes modĂšles pour lâavancement de la biologie synthĂ©tique et de la biologie des systĂšmes. Câest le cas pour Mesoplasma florum, une bactĂ©rie Ă©troitement apparentĂ©e aux mycoplasmes du groupe de Mycoplasma mycoides (mycoides cluster). Contrairement Ă la plupart des mycoplasmes, M. florum ne possĂšde aucun pouvoir pathogĂšne connu et croĂźt rapidement en conditions de laboratoire. De plus, M. florum possĂšde un gĂ©nome comprenant seulement 793 224 paires de bases et 685 sĂ©quences codantes pour des protĂ©ines, ce qui positionne cette bactĂ©rie parmi les organismes Ă rĂ©plication autonome les plus simples connus Ă ce jour.
MalgrĂ© ces avantages considĂ©rables, seulement quelques Ă©tudes avaient jusquâĂ tout rĂ©cemment spĂ©cifiquement explorĂ© la biologie de M. florum, et ce mĂȘme si sa dĂ©couverte remonte Ă prĂšs de 40 ans. Ainsi, lors du commencement de mon doctorat, plusieurs aspects importants concernant ce microorganisme demeuraient toujours Ă dĂ©finir. Par exemple, pratiquement aucune donnĂ©e quantitative sur la physiologie de cette bactĂ©rie Ă©tait Ă ce moment-lĂ disponible dans la littĂ©rature, et aucune Ă©tude sur lâexpression de ses gĂšnes nâavait encore Ă©tĂ© entreprise. De plus, trĂšs peu voire mĂȘme aucun outil molĂ©culaire nâĂ©tait disponible afin de modifier le gĂ©nome de M. florum, ce qui constituait une limitation technique importante Ă lâĂ©tude de la biologie de cet organisme, en plus de restreindre son utilisation en tant que chĂąssis cellulaire pour lâingĂ©nierie microbienne et le dĂ©veloppement dâapplications biotechnologiques.
Face Ă cette problĂ©matique, jâai tout dâabord dĂ©veloppĂ© un systĂšme de culture en continu flexible et peu dispendieux permettant de faire croĂźtre M. florum dans des conditions contrĂŽlĂ©es, stables et hautement reproductibles. Cet appareil offre plusieurs modes de fonctionnement pour accommoder les diffĂ©rents besoins rencontrĂ©s en laboratoire, et nous avons rendu les dĂ©tails de sa conception entiĂšrement disponibles pour lâensemble de la communautĂ© scientifique. En diminuant les fluctuations physiologiques des cellules, ce systĂšme de culture permet de rĂ©duire les variations expĂ©rimentales lors de lâĂ©tude de M. florum, et ainsi de gĂ©nĂ©rer des donnĂ©es plus facilement interprĂ©tables et comparables entre expĂ©riences.
Jâai ensuite dĂ©veloppĂ© les tout premiers plasmides spĂ©cifiquement conçus pour se rĂ©pliquer chez M. florum. BasĂ©s sur lâorigine de rĂ©plication du chromosome, ces plasmides ont permis de tester la fonctionnalitĂ© de diffĂ©rents marqueurs de sĂ©lection aux antibiotiques, en plus de mettre au point diffĂ©rentes mĂ©thodes de transformation pour cette bactĂ©rie. GrĂące Ă leur tendance naturelle Ă recombiner avec le chromosome, ces plasmides ont dâailleurs servi de fondement Ă la technique dĂ©veloppĂ©e par notre laboratoire afin de cloner le gĂ©nome complet de M. florum dans la levure. Cette souche de levure peut maintenant servir de plateforme afin de modifier efficacement le gĂ©nome de M. florum et ensuite le transplanter dans une cellule rĂ©ceptrice.
Finalement, jâai procĂ©dĂ© Ă la caractĂ©risation approfondie de cette bactĂ©rie quasi minimale en combinant diffĂ©rentes mĂ©thodes expĂ©rimentales et approches intĂ©gratives. Cette caractĂ©risation intĂ©grative comprend la mesure de plusieurs aspects physiques et physiologiques propres Ă M. florum, incluant son temps de doublement, diamĂštre cellulaire, masse cellulaire sĂšche, ainsi que la dĂ©finition des fractions macromolĂ©culaires de celle-ci. Jâai Ă©galement rĂ©alisĂ© les premiĂšres analyses du transcriptome et du protĂ©ome de ce microorganisme afin de dĂ©finir les unitĂ©s transcriptionnelles, estimer les abondances molĂ©culaires absolues de chacun des transcrits et protĂ©ines exprimĂ©es, de mĂȘme quâĂ©valuer lâimportance globale des fonctions cellulaires prĂ©dites. En plus dâaugmenter nos connaissances fondamentales sur diffĂ©rents aspects de la biologie de M. florum, ces efforts de caractĂ©risation serviront de fondation pour le dĂ©veloppement dâun modĂšle Ă lâĂ©chelle du gĂ©nome dĂ©crivant le mĂ©tabolisme de cette bactĂ©rie.
Lâensemble de ces efforts visent Ă acquĂ©rir les connaissances et les outils molĂ©culaires nĂ©cessaires afin de transformer M. florum en une plateforme simplifiĂ©e, hautement caractĂ©risĂ©e et spĂ©cialement conçue pour explorer les rĂšgles gouvernant lâorganisation et la plasticitĂ© des gĂ©nomes, ainsi que les mĂ©canismes cellulaires Ă la base du fonctionnement des cellules. Une telle plateforme a le potentiel de transformer la biologie synthĂ©tique en une discipline logique, prĂ©visible et reproductible, rendant ainsi possible le prototypage rationnel et efficace de gĂ©nomes dans le but de produire des souches bactĂ©riennes capables dâaccomplir des tĂąches bien prĂ©cises
CaractĂ©risation intĂ©grative et dĂ©veloppement dâoutils molĂ©culaires chez la bactĂ©rie "Mesoplasma florum"
LâĂ©mergence de la biologie synthĂ©tique marque lâentrĂ©e dans une nouvelle Ăšre oĂč il sera possible de modifier et reprogrammer des gĂ©nomes entiers afin de rĂ©pondre Ă des besoins spĂ©cifiques. Ce domaine de recherche est par consĂ©quent appelĂ© Ă jouer un rĂŽle de premier plan dans le dĂ©veloppement de nouvelles technologies visant Ă sâattaquer Ă certains des plus grands dĂ©fis du 21e siĂšcle tels que la multirĂ©sistance aux antibiotiques, la production dâĂ©nergies renouvelables et le traitement de maladies comme le cancer ou le diabĂšte. Notre habiletĂ© actuelle Ă programmer des comportements cellulaires prĂ©visibles est cependant trĂšs limitĂ©e, principalement parce que les organismes modĂšles couramment utilisĂ©s possĂšdent une complexitĂ© qui dĂ©passe nos capacitĂ©s dâanalyse et que les rĂšgles fondamentales qui gouvernent le fonctionnement global des cellules demeurent encore mal comprises.
En raison de leurs gĂ©nomes remarquablement petits, les bactĂ©ries appartenant Ă la classe des Mollicutes reprĂ©sentent des candidats particuliĂšrement intĂ©ressants afin de dĂ©cortiquer le fonctionnement intĂ©gral de cellules via les approches intĂ©gratives de la biologie des systĂšmes et de la gĂ©nomique synthĂ©tique. La majoritĂ© de ces microorganismes sont toutefois caractĂ©risĂ©s par un style de vie parasitaire, des capacitĂ©s mĂ©taboliques rĂ©duites et une croissance relativement lente nĂ©cessitant lâutilisation de milieux de culture complexes. Conjointement au manque dâoutils gĂ©nĂ©tiques efficaces, ces caractĂ©ristiques restreignent considĂ©rablement leur manipulation en laboratoire. Certains Mollicutes se dĂ©marquent nĂ©anmoins en tant quâorganismes modĂšles pour lâavancement de la biologie synthĂ©tique et de la biologie des systĂšmes. Câest le cas pour Mesoplasma florum, une bactĂ©rie Ă©troitement apparentĂ©e aux mycoplasmes du groupe de Mycoplasma mycoides (mycoides cluster). Contrairement Ă la plupart des mycoplasmes, M. florum ne possĂšde aucun pouvoir pathogĂšne connu et croĂźt rapidement en conditions de laboratoire. De plus, M. florum possĂšde un gĂ©nome comprenant seulement 793 224 paires de bases et 685 sĂ©quences codantes pour des protĂ©ines, ce qui positionne cette bactĂ©rie parmi les organismes Ă rĂ©plication autonome les plus simples connus Ă ce jour.
MalgrĂ© ces avantages considĂ©rables, seulement quelques Ă©tudes avaient jusquâĂ tout rĂ©cemment spĂ©cifiquement explorĂ© la biologie de M. florum, et ce mĂȘme si sa dĂ©couverte remonte Ă prĂšs de 40 ans. Ainsi, lors du commencement de mon doctorat, plusieurs aspects importants concernant ce microorganisme demeuraient toujours Ă dĂ©finir. Par exemple, pratiquement aucune donnĂ©e quantitative sur la physiologie de cette bactĂ©rie Ă©tait Ă ce moment-lĂ disponible dans la littĂ©rature, et aucune Ă©tude sur lâexpression de ses gĂšnes nâavait encore Ă©tĂ© entreprise. De plus, trĂšs peu voire mĂȘme aucun outil molĂ©culaire nâĂ©tait disponible afin de modifier le gĂ©nome de M. florum, ce qui constituait une limitation technique importante Ă lâĂ©tude de la biologie de cet organisme, en plus de restreindre son utilisation en tant que chĂąssis cellulaire pour lâingĂ©nierie microbienne et le dĂ©veloppement dâapplications biotechnologiques.
Face Ă cette problĂ©matique, jâai tout dâabord dĂ©veloppĂ© un systĂšme de culture en continu flexible et peu dispendieux permettant de faire croĂźtre M. florum dans des conditions contrĂŽlĂ©es, stables et hautement reproductibles. Cet appareil offre plusieurs modes de fonctionnement pour accommoder les diffĂ©rents besoins rencontrĂ©s en laboratoire, et nous avons rendu les dĂ©tails de sa conception entiĂšrement disponibles pour lâensemble de la communautĂ© scientifique. En diminuant les fluctuations physiologiques des cellules, ce systĂšme de culture permet de rĂ©duire les variations expĂ©rimentales lors de lâĂ©tude de M. florum, et ainsi de gĂ©nĂ©rer des donnĂ©es plus facilement interprĂ©tables et comparables entre expĂ©riences.
Jâai ensuite dĂ©veloppĂ© les tout premiers plasmides spĂ©cifiquement conçus pour se rĂ©pliquer chez M. florum. BasĂ©s sur lâorigine de rĂ©plication du chromosome, ces plasmides ont permis de tester la fonctionnalitĂ© de diffĂ©rents marqueurs de sĂ©lection aux antibiotiques, en plus de mettre au point diffĂ©rentes mĂ©thodes de transformation pour cette bactĂ©rie. GrĂące Ă leur tendance naturelle Ă recombiner avec le chromosome, ces plasmides ont dâailleurs servi de fondement Ă la technique dĂ©veloppĂ©e par notre laboratoire afin de cloner le gĂ©nome complet de M. florum dans la levure. Cette souche de levure peut maintenant servir de plateforme afin de modifier efficacement le gĂ©nome de M. florum et ensuite le transplanter dans une cellule rĂ©ceptrice.
Finalement, jâai procĂ©dĂ© Ă la caractĂ©risation approfondie de cette bactĂ©rie quasi minimale en combinant diffĂ©rentes mĂ©thodes expĂ©rimentales et approches intĂ©gratives. Cette caractĂ©risation intĂ©grative comprend la mesure de plusieurs aspects physiques et physiologiques propres Ă M. florum, incluant son temps de doublement, diamĂštre cellulaire, masse cellulaire sĂšche, ainsi que la dĂ©finition des fractions macromolĂ©culaires de celle-ci. Jâai Ă©galement rĂ©alisĂ© les premiĂšres analyses du transcriptome et du protĂ©ome de ce microorganisme afin de dĂ©finir les unitĂ©s transcriptionnelles, estimer les abondances molĂ©culaires absolues de chacun des transcrits et protĂ©ines exprimĂ©es, de mĂȘme quâĂ©valuer lâimportance globale des fonctions cellulaires prĂ©dites. En plus dâaugmenter nos connaissances fondamentales sur diffĂ©rents aspects de la biologie de M. florum, ces efforts de caractĂ©risation serviront de fondation pour le dĂ©veloppement dâun modĂšle Ă lâĂ©chelle du gĂ©nome dĂ©crivant le mĂ©tabolisme de cette bactĂ©rie.
Lâensemble de ces efforts visent Ă acquĂ©rir les connaissances et les outils molĂ©culaires nĂ©cessaires afin de transformer M. florum en une plateforme simplifiĂ©e, hautement caractĂ©risĂ©e et spĂ©cialement conçue pour explorer les rĂšgles gouvernant lâorganisation et la plasticitĂ© des gĂ©nomes, ainsi que les mĂ©canismes cellulaires Ă la base du fonctionnement des cellules. Une telle plateforme a le potentiel de transformer la biologie synthĂ©tique en une discipline logique, prĂ©visible et reproductible, rendant ainsi possible le prototypage rationnel et efficace de gĂ©nomes dans le but de produire des souches bactĂ©riennes capables dâaccomplir des tĂąches bien prĂ©cises
An engineered Mycoplasma pneumoniae to fight Staphylococcus aureus
Bacterial infections are commonly treated with antimicrobials, but the rise of multiâdrug resistance and the presence of biofilms can compromise treatment efficacy. Recently, new approaches using live bacteria or engineered microorganisms have gained attention in the fight against several diseases. In their recent work, LluchâSenar and colleagues (Garrido et al, 2021) genetically modified the lung pathogen Mycoplasma pneumoniae to attenuate its virulence and secrete antibiofilm and bactericidal enzymes. Their strategy successfully altered a Staphylococcus aureus biofilm on catheters implanted in mice, providing an additional demonstration of the potential of genetically engineered microorganisms as therapeutic agents
A Small-Volume, Low-Cost, and Versatile Continuous Culture Device
<div><p>Background</p><p>Continuous culture devices can be used for various purposes such as establishing reproducible growth conditions or maintaining cell populations under a constant environment for long periods. However, commercially available instruments are expensive, were not designed to handle small volumes in the milliliter range, and can lack the flexibility required for the diverse experimental needs found in several laboratories.</p><p>Methodology/Principal Findings</p><p>We developed a versatile continuous culture system and provide detailed instructions as well as a graphical user interface software for potential users to assemble and operate their own instrument. Three culture chambers can be controlled simultaneously with the proposed configuration, and all components are readily available from various sources. We demonstrate that our continuous culture device can be used under different modes, and can easily be programmed to behave either as a turbidostat or chemostat. Addition of fresh medium to the culture vessel can be controlled by a real-time feedback loop or simply calibrated to deliver a defined volume. Furthermore, the selected light-emitting diode and photodetector enable the use of phenol red as a pH indicator, which can be used to indirectly monitor the bulk metabolic activity of a cell population rather than the turbidity.</p><p>Conclusions/Significance</p><p>This affordable and customizable system will constitute a useful tool in many areas of biology such as microbial ecology as well as systems and synthetic biology.</p></div
Illustration of available continuous culture modes used to maintain cell growth.
<p>(A) Under its present software configuration, the versatile continuous cultivation device (VCCD) can behave like a turbidostat or a chemostat, or simply be used to measure the transmittance of a batch culture without performing any culture refresh. In the turbidostat mode, the culture is refreshed when a desired transmittance value is detected until: 1) a second value is reached [Real-time feedback loop] or 2) a specified refresh time has elapsed [Threshold-activated]. Alternatively, the chemostat behavior uses a Time interval mode to refresh the culture with a constant specified dilution rate. (B) In the Time interval mode, additional options are available to choose if the interval timer starts at a specified value or at a specified time, and to decide if refreshes are stopped in a time-dependent manner or using a transmittance threshold.</p
Typical transmittance curves associated with bacterial growth.
<p>(A) Increasing opacity observed when monitoring transmittance of an <i>E</i>. <i>coli</i> culture in LB broth, where the growing cells increasingly block the incident light generated by a light emitting diode. (B) In some cases, growth can alternatively be measured by adding phenol red to the growth medium as a pH indicator. This method is especially employed to follow the growth of <i>M</i>. <i>florum</i> in ATCC 1161 medium, where medium acidification caused by metabolic activity is reported by an increase in the 560nm transmittance.</p
Calibration of the Versatile continuous culture device (VCCD) using batch cultures.
<p>(A) Comparison of 560nm transmittance measured by the VCCD and 600nm absorbance measured by a conventional spectrophotometer of an <i>E</i>. <i>coli</i> culture in LB broth. (B) Relationship between relative 560nm transmittance measured by the VCCD and cell density of an <i>E</i>. <i>coli</i> culture grown in LB broth. Red squares are excluded from the correlation determination because they are not part of the exponential growth phase. (C) Relationship between relative 560nm transmittance measured by the VCCD and cell density of <i>S</i>. <i>cerevisae</i> growing in YPAD 2% glucose medium. (D) Relative 560nm transmittance of ATCC 1161 medium through different pH values generally observed during <i>M</i>. <i>florum</i> growth. (E) Cell density of <i>M</i>. <i>florum</i> growing in ATCC 1161 medium through pH decrease. (F) Relationship between relative 560nm transmittance measured by the VCCD and cell density of an <i>M</i>. <i>florum</i> culture grown in ATCC 1161 medium.</p
Cloning and transplantation of the <em>Mesoplasma florum</em> genome.
Cloning and transplantation of bacterial genomes is a powerful method for the creation of engineered microorganisms. However, much remains to be understood about the molecular mechanisms and limitations of this approach. We report the whole-genome cloning of Mesoplasma florum in Saccharomyces cerevisiae, and use this model to investigate the impact of a bacterial chromosome in yeast cells. Our results indicate that the cloned M. florum genome is subjected to weak transcriptional activity, and causes no significant impact on yeast growth. We also report that the M. florum genome can be transplanted into Mycoplasma capricolum without any negative impact from the putative restriction enzyme encoding gene mfl307. Using whole-genome sequencing, we observed that a small number of mutations appeared in all M. florum transplants. Mutations also arose, albeit at a lower frequency, when the M. capricolum genome was transplanted into M. capricolum recipient cells. These observations suggest that genome transplantation is mutagenic, and that this phenomenon is magnified by increased phylogenetic distance between the genome donor and the recipient cell. No difference in efficiency was detected after three successive rounds of genome transplantation, suggesting that the observed mutations were not selected during the procedure. Taken together, our results provide a more accurate picture of the events taking place during bacterial genome cloning and transplantation
Hardware configuration and schematic depiction of culture-refreshing steps.
<p>(A) Three-dimensional representation of the versatile continuous cultivation device (VCCD). The system consists of three independently controlled continuous culture units supported by a plexiglass acrylic structure. For each unit, transmittance is measured through the culture chamber by a light-emitting diode coupled to a photo receiver and then reported to a user interface control system. The culture refreshing capability is provided by computer-controlled pinch valves that manage air and liquid flows inside each culture unit. (B) First step of a culture refresh cycle (culture dilution). Upon pinch valve activation, two tubes of the culture unit get pinched, and the air flow is diverted to the medium bottle resulting in the addition of medium into the culture tube. (C) Second step of a culture refresh cycle (excess culture removal). By returning the pinch valve to its original position, two tubes of the culture unit are pinched, which then redirects the air flow to the culture tube and causes the excess of volume to be evacuated into the trash bottle.</p