A short version of the amyloid-like protein TasA fibrillates and supports biofilm formation in Bacillus cereus

The formation of bacterial biofilms is a doable thanks to the assembly of an extracellular matrix that provides to the entire community with i) an outstanding architectonic structure and ii) protection to the cells from external aggressions. In Bacillus subtilis, a structural element dedicated to the formation of the extracellular matrix is the amyloid-like protein TasA. To form fibers, TasA needs the participation of the protein TapA. Indeed, a tapA mutant resembles phenotypically to a tasA mutant, which is wrinkle-less pellicles or colonies with no distinguishable morphological features. tasA is widely spread within the Bacillus genus, but tapA is absent in the heterogeneous group of Bacillus cereus which includes environmental and pathogenic members; some of them are responsible for important food intoxication outbreaks. Then, we asked whether TasA would still retain functionality in biofilm formation in B. cereus. Comparative genomic analysis showed a region in B. cereus containing two orthologous of tasA, tasA and calY, and the orthologous of sipW, that encodes a signal peptidase. Our mutagenic studies revealed that the entire region was relevant for biofilm formation, and electron microscopy proved the major propensity of TasA than CalY to form fibers in the cell surfaces. These findings also indicated that in B. cereus as opposed to B. subtilis, an accessory TapA protein is not necessary for the fibrillation of TasA. Indeed, the heterologous expression of this region of B. cereus restored the capacity of a B. subtilis tasA operon mutant or a single tasA mutant to form pellicles. These pellicles stained with the amyloid dye Congo Red and the cells were decorated with fibers, both findings suggestive of an amyloid-like nature of the B. cereus TasA. Intriguingly, in a B. subtilis tapA mutant, only the entire region of B. cereus fully rescued pellicle formation, fibrillation or Congo Red staining, to a lesser extent did sipw-tasA, and no restoration was observed with sipW-calY. These observations led us to speculate that TapA might cross seed the fibrillation of TasA or CalY in B. subtilis. In summary, TasA is relevant for biofilm formation in these two bacterial species, which appears to be governed by its polymerizing nature. The fact that we count with two bacterial species containing versions of TasA with subtle differences will be of great value in our studies of the mechanistic of polymerization of these bacterial amyloid-like fibers and their contribution to the assembly of the extracellular matrix.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Compounds produced by two robust Bacillus amyloliquefaciens biocontrol strains involved in antimicrobial activity and plant-growth promotion

Several members of the Bacillus genus are potential candidates to be used as biological control agents to combat pests or plant diseases. The bacterial attributes associated to Bacillus behaviour are mainly: the production of antimicrobial compounds, the plant-growth promotion capability and the induction of systemic resistance in plant host. In previous works, we have demonstrated this multifaceted biocontrol activity of B. amyloliquefaciens CECT8237 (UMAF6639) and CECT8238 (UMAF6614) strains, which contributes to plant protection against bacterial and fungal pathogens. In order to identify the bacterial features responsible for the outstanding biocontrol activity of these strains, their genomes were sequenced and analysed. Firstly, those features previously described for other Bacillus to be involved in the biocontrol activity were localized: i) Biosynthetic genes of secondary metabolites. Apart from the lipopeptides, formerly detected, we have demonstrated the production of other additional compounds that might participate in the antibiosis activity; ii) Biosynthetic genes of the volatile compounds 2,3-butanediol and acetoin, both involved in the induction of plant defence responses. Secondly, genetic singularities non-conserved within the Bacillus genus, which might contribute to the biocontrol ability of B. amyloliquefaciens CECT8237 and CECT8238 were identified in both genomes. Among them, we highlight two genomic regions hypothetically implicated in the production of non-characterized secondary metabolites. Ongoing studies are focused on elucidating the functionality of these uncharacterized regions, leading to a better understanding of the mechanisms of action involved in the robust biocontrol skills of these strains.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

The expression profile of secondary metabolites in biofilms of B. amyloliquefaciens CECT 8237 biocontrol strain

The contribution of Bacillus amyloliquefaciens CECT 8237 (UMAF6639) strain to the plant protection against bacterial and fungal pathogens is mainly based on: i) the production of antimicrobial compounds, ii) the plant-growth promotion capability and iii) the induction of systemic resistance in plant host. In previous works, we demonstrated the relevant implication of the three families of lipopeptides in the biocontrol activity and biofilm formation on melon leaves. The analysis of the genome sequence revealed features previously identified in other Bacillus strains, such as genes related to biofilm formation, phytostimulation and induction of systemic resistance in the host plant, and novel genomic regions non-conserved within the Bacillus genus, and therefore with potential genes implicated in the biocontrol activity. Considering the relevance of biofilm formation and production of secondary metabolites in biocontrol, we analyzed the expression profile of several secondary metabolites produced by CECT 8237 in biofilm inducing conditions. To do so, we optimized an in situ detection method based on MALDI-TOF analysis of secondary metabolites within the bacterial colony and in supernatants and pellicles of B. amyloliquefaciens biofilms. We found a major accumulation of these secondary metabolites in the core and middle area of the colony and in the spent medium compared to pellicle. Further studies will help elucidating the real implication of these molecules in the bacterial ecology or in its mechanisms of defence, against competitors, and/or offense, against pathogens and its possible relation with the niche they occupy. This work was supported by grants from the Plan Nacional I+D+I (AGL-2012-31968) and Incentivos a Proyectos de Excelencia de la Junta de Andalucía (P10-AGR-57-97), both cofinanced by FEDER funds (EU). This work was also supported by grant from Koppert B.V. (8.06/60.4086) and European Research Council-Starting Grant BacBio ERC637971.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Transformación de Podosphaera xanthii mediante Agrobacterium tumefaciens y su aplicación para el estudio de efectores

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren células vivas para completar su ciclo de vida. Esto se debe a que estos hongos patógenos desarrollan una estructura especializada en el interior de las células de la planta, denominada haustorio, estableciendo una íntima relación con su hospedador. El haustorio es el responsable de la toma de nutrientes y el intercambio de factores con la planta. Estos factores son los denominados efectores, pequeñas proteínas secretadas por el patógeno responsables de la inhibición o modificación de la defensa innata de la planta. El análisis de estos efectores ha focalizado un gran interés en los últimos años, haciéndose necesaria la puesta a punto de técnicas para la manipulación genética de estos patógenos. Hasta la fecha, se han desarrollado varios métodos para transformar hongos filamentosos, sin embargo, debido al estilo de vida de estos patógenos, estas estrategias de transformación o no son adecuadas o no han dado resultados satisfactorios. Recientemente, se han desarrollado metodologías para el estudio y análisis de efectores usando la planta como vector para la expresión de construcciones para el silenciamiento o la sobreexpresión de estas proteínas, sin embargo, la localización y el mecanismo de secreción de los efectores sigue siendo desconocido. En este trabajo hemos desarrollado un método para la transformación de Podosphaera xanthii, el principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas, usando Agrobacterium tumefaciens como vector de transformación. Mediante este método, hemos obtenido transformantes estables para una variedad de construcciones: i) plásmidos expresando el gen egfp bajo el control de promotores constitutivos o inducibles de Aspergilus nidulans, ii) plásmidos expresando el casete de resistencia a higromicina B o un alelo de β-tubulina de P. xanthii que confiere resistencia a fungicidas MBC. Tras la transformación, las colonias de los transformantes fueron analizas mediante microscopía confocal, resultando ser estables tras sucesivas generaciones cuando se aplicaba el marcador de resistencia y presentando el mismo aspecto que las colonias no transformadas del parental. Además, los análisis moleculares mostraron la presencia del T-DNA en las colonias transformadas de P. xanthii. El objetivo de este trabajo es poner a punto un método para el estudio de los posibles efectores de P. xanthii. Por ello, se llevaron a cabo estudios de microscopía confocal con fusiones traduccionales de efectores candidatos de P. xanthii fusionados a GFP. Entre los efectores ensayados, destacó la presencia de una amplia familia de efectores localizados en la papila y en pequeñas vesículas del haustorio, así como un efector de localización en la membrana del hongo. Estos resultados demuestran la fiabilidad de este método para la transformación de P. xanthii y abre una nueva vía para el estudio de efectores candidatos directamente en el patógeno sin mediar la planta.Universidad de Málaga, Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Plan Nacional de I+D+i del Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R), cofinanciado con fondos FEDER (UE)

Aplicación para la administración de departamento de venta de un centro comercial (iPhone)

Proyecto orientado a ser una herramienta, para poder controlar y gestionar el stock de un departamento de venta de un centro comercial. Basado en dos aplicaciones. La primera, destinada a ser la herramienta mediante la cual el administrador del departamento, puede crear el entorno bajo la cual va a funcionar, controlar el stock y todas las operaciones que se realizan. La segunda, ejecutada en una plataforma móvil (iPhone), será una herramienta de gran utilidad para los vendedores, que les permitirá controlar el stock y realizar gestiones.Projecte orientat a ser una eina, per a poder controlar i gestionar l'estoc d'un departament de venda d'un centre comercial. Basat en dues aplicacions. La primera, destinada a ser l'eina mitjançant la qual l'administrador del departament pot crear l'entonr sota la qual va a funcionar, controlar l'estoc i totes les operacions que es realitzen. La segona, executada en una plataforma mòbil (iPhone), serà una eina de gran utilitat per als venedors, que els permetrà controlar l'estoc i realitzar gestions.Project aimed at being a tool to control and manage the stock of a sales department of a mall. Based on two applications. The first, intented to be the tool by which the department administrator can create the environment under which it will work, stock control and all operations ar performed. The second, executed in a mobile (iPhone) will be a useful tool for sellers of the mall, allowing them to control the stock and make arrangements

Adhesin proteins in biofilms of the food-borne pathogen Bacillus cereus

One of the greatest challenges of the food industry is to reduce food poisoning caused by food-borne pathogenic bacteria. Bacillus cereus is one the recurrent bacterial pathogens responsible of many outbreaks. Biofilm formation and sporulation are thought as the most important reservoirs of B. cereus. Biofilms are bacterial communities difficult to eradicate from biotic and abiotic surfaces. They are usually composed of exopolysaccharides and proteins. In our study, we are interested in the characterization of the molecular bases leading to biofilm formation in B. cereus during the interaction with plants. To start this analysis we have focused on the structural components of the extracellular matrix of these biofilms. Using as a model the well-studied B. subtilis, we show in this work the presence in B. cereus of an orthologous of tasA. TasA forms amyloid-like fibers in the extracellular matrix of B. subtilis. We demonstrate that the heterologous expression of this allele in a B. subtilis strain lacking the entire tasA operon and unable to form biofilm, restores the assembly of biofilm formation. Biochemical and morphological studies of this protein let us think on a possible amyloid-like nature of this protein, which could be involved in cell-cell interaction and biofilm formation as it does in B. subtilisUniversidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Una región genómica implicada en la formación de fibras tipo amiloide en biofilms de Bacillus cereus

Bacillus cereus es una bacteria patógena responsable de numerosos brotes de intoxicación alimentaria. Las esporas y el biofilm son considerados los reservorios más importantes de B. cereus que se pueden encontrar en frutas y verduras frescas contaminadas. Los biofilms son comunidades bacterianas difíciles de erradicar de superficies bióticas y abióticas debido a una matriz extracelular estable que recubre y protege a las células bacterianas. Estas matrices extracelulares suelen estar formadas de exopolisacáridos, proteínas, ADN extracelular, y otros componentes minoritarios. Estudios de biofilms en Bacillus subtilis, especie filogenéticamente relacionada con B. cereus, han demostrado la existencia de fibras tipo amiloide en su matriz extracelular, y su relevancia en el desarrollo de biofilms. El objetivo de este trabajo ha sido investigar la existencia de este tipo de proteínas en B. cereus y su implicación en la formación de biofilms. El análisis comparativo de los genomas de B. subtilis y B. cereus nos permitió identificar una región genómica que contiene dos loci que codifican ortólogos de la proteína tipo amiloide TasA y un ortólogo de la correspondiente peptidasa señal SipW, responsable del correcto procesamiento de TasA previo a su secreción. La mutación de esta región genómica condujo a la incapacidad de B. cereus de formar biofilms, un fenotipo compartido por mutantes en el gen sipW. Los mutantes en tasA o calY no perdieron completamente la capacidad de formación de biofilms, aunque desarrollaron fenotipos diferenciados entre sí. El estudio con microscopía electrónica reveló que TasA, y en menor medida CalY, polimerizan en forma de fibras largas y abundantes en la superficie de las células. La expresión heteróloga de estos loci en una cepa de B. subtilis que carece de los factores necesarios para el ensamblaje de fibras de tipo amiloide de TasA reveló: (i) la implicación de esta región genómica B. cereus en la formación de películas en la interfase aire-líquido y (ii) la capacidad intrínseca de TasA para formar fibras similares a las fibras formadas por su ortólogo en B. subtilis. Los resultados obtenidos en este estudio indican: (i) La implicación de la región genómica que contiene los genes sipW, tasA y calY en la formación de biofilms de B. cereus en superficies abióticas, (ii) las propiedades adhesivas de TasA y CalY, y (iii) la potencial naturaleza amiloide de la proteína TasA de B. cereus como su ortólogo en B. subtilis. Este trabajo ha sido financiado con una ayuda del Plan Nacional de I+D+i del Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2012-31968), cofinanciado con fondos FEDER (UE)Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Análisis funcional de efectores candidatos de Podosphaera xanthii: la vía para descubrir nuevas dianas para fungicidas en oídios

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren las células vivas de su hospedador para completar su ciclo de vida asexual. Estos patógenos desarrollan una estructura especializada responsable de la absorción de nutrientes y del intercambio de factores con la planta denominada 'haustorio'. Estos factores son los denominados efectores, pequeñas proteínas secretadas responsables de inhibir y modificar la respuesta de defensa de la planta. Algunos de estos efectores desempeñan papeles importantes en el desarrollo del hongo, incluso algunos son esenciales para la infección. Recientemente hemos secuenciado y anotado el transcriptoma epifítico de Podosphaera xanthii, principal agente causal del oídio de las cucurbitáceas en el sur de España, y hemos identificado 119 efectores candidatos (ECP). El objetivo de este trabajo es identificar los verdaderos efectores de P. xanthii que tienen un papel importante en la interacción planta-hongo patógeno y diseñar nuevos fungicidas para inhibir su funcionalidad. Materiales y métodos: A partir del transcriptoma epifítico, se analizaron tres efectores candidatos mediante silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) y la sobreexpresión de dichos efectores en cotiledones de melón, utilizando para ello el método de agroinfiltración. Posteriormente, se examinó la inducción de la respuesta de defensa en planta mediante la detección histoquímica de especies reactivas de oxígeno y la acumulación de depósitos de calosa, así como los cambios en el desarrollo del hongo.El silenciamiento de los tres efectores analizados provocó una respuesta de defensa de la planta, observándose diferencias en la acumulación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y calosa, lo que sugiere la diferente implicación de estos efectores en la infección. En concreto, el efector ECP2707 parece interferir específicamente con la formación de la papila, primera barrera de defensa de la planta, impidiendo o ralentizando la penetración en la célula vegetal. El silenciamiento del efector ECP5191 dio lugar al aumento del número de células que acumulaban H2O2 y calosa, así como una disminución en el número de puntos de penetración del hongo, observándose todo lo contrario cuando se sobreexpresa dicho efector. El silenciamiento del efector ECP6385 se tradujo en la completa inhibición de la infección, mostrándose una respuesta similar a la producida en las plantas resistentes: una fuerte acumulación de H2O2 y calosa en los puntos de penetración. Además, la fusión traduccional ECP5191-GFP ha permitido localizar este efector de P. xanthii en los puntos de penetración y vesículas del haustorio del hongo. Tras los resultados obtenidos, podemos concluir que esta metodología puede ser útil para la identificación de efectores de P. xanthii con un papel en la patogénesis. Además, en el caso de ECP6385, los resultados sugieren que sería una buena diana para el desarrollo de nuevos fungicidas.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo ha sido financiado por ayudas del Plan Nacional de I+D+I del anterior Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) (AGL2013-41939-R), cofinanciado con fondos FEDER (UE

Identificación de una familia de quitinasas de Podosphaera xanthii implicadas en las manipulación de la inmunidad disparada por quitina

Los oídios son patógenos biotrofos obligados que requieren células vivas para completar su ciclo de vida, por lo que deben eludir o inhibir las respuestas de defensa de la planta mediante la secreción de efectores. El haustorio, estructura del hongo especializada en la toma de nutrientes, es también la vía de intercambio de factores con las células huésped. Hasta la fecha, son muy numerosos los efectores identificados en diversos hongos fitopatógenos, sin embargo, es poco lo conocido acerca de los efectores de oídios. En este trabajo hemos desarrollado un método para el análisis de efectores candidatos de Podosphaera xanthii (ECP), agente causal del oídio de las cucurbitáceas, mediante el silenciamiento génico inducido por el hospedador (HIGS) en cotiledones de melón, utilizando para ello Agrobacterium tumefaciens. El silenciamiento de efectores candidatos provocó diferente respuesta de defensa en planta, observándose diferencias en la acumulación de H2O2, lo que sugiere la diferente implicación de estos efectores en la infección. Además, la activación de la respuesta en planta se tradujo en un efecto negativo sobre el desarrollo del hongo. En paralelo, se realizó el modelado y el análisis informático de los efectores. En especial destacan los efectores ECHA, cuyo modelo muestra homología con quitinasas. Los análisis in vitro validaron la actividad predicha de estos efectores. Además, el doble silenciamiento de efectores ECHA y el receptor de quitina de melón CERK1, muestra que estos efectores modulan la inmunidad disparada por el reconocimiento de quitina. Mediante la fusión traduccional ECP5191-GFP (efector ECHA), se han localizado estos efectores en los puntos de penetración, lugar donde se acumula gran cantidad de quitina. Tras los resultados obtenidos, podemos concluir los efectores ECHA constituyen una familia de quitinasas con papel en la patogénesis. Además, los resultados confirman que esta metodología es útil para la identificación de efectores de P. xanthii. Este trabajo ha sido financiado por ayudas del Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-41939-R), cofinanciado con fondos FEDER (UE).Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Evaluación de la capacidad nematicida de los agentes de biocontrol UMAF6614 y UMAF6639

Los nematodos fitoparásitos son uno de los grupos de patógenos de cultivos más destructivos causando graves pérdidas anuales a nivel mundial. La mayoría de los nematodos fitoparásitos se localizan en el suelo siendo patógenos de la raíz, lo que implica una gran dificultad en cuanto a su control y erradicación. Hoy en día, la aplicación de agentes químicos sigue siendo el método más común para la gestión y control de estos patógenos. Sin embargo, debido a la crecientes preocupaciones sobre los problemas de seguridad del medio ambiente y salud pública, muchos nematicidas químicos con alto grado de toxicidad se han retirado o se ha restringido su uso. Por tanto, urge desarrollar alternativas ecológicas para el control de estos patógenos. El empleo de bacterias beneficiosas para combatir plagas o enfermedades de plantas ha cobrado gran importancia en las últimas décadas. Entre las diferentes especies microbianas estudiadas, los miembros del género Bacillus se han demostrado eficaces para su uso como agentes de control biológico. En un estudios previos, se demostró que las cepas de Bacillus amyloliquefaciens, UMAF6614 y UMAF6639, son excelentes candidatas como agentes de biocontrol contra enfermedades fúngicas y bacterianas de las cucurbitáceas. Tras realizar los ensayos de mortalidad se ha visto que estas cepas tienen actividad nematicida pero se desconoce cuáles son los factores que median esta actividad y el modo de acción de dichos factores. Por tanto, en este trabajo se integran técnicas de química analítica y aproximaciones genómicas para identificar los compuestos responsables de dicha actividad y regiones en el genoma que codifiquen compuestos con actividad nematicida