Setting up of the process of expansion of dental tissue derived cells

La presencia de células madre (CM) en tejidos dentales abrió nuevas líneas de investigación en el área de la odontología regenerativa. Los objetivos de este trabajo fueron poner a punto el método de obtención, aislamiento y expansión de CM derivadas de tejidos dentales y caracterizarlas. Se utilizaron terceros molares cuyas pulpas y saco periodontal se procesaron de la siguiente manera: 1) digestión enzimática; 2) obtención de explantes. En ambos casos, se cultivaron en DMEM suplementado. Las células fueron caracterizadas en el estadio P2 (pasaje 2) mediante el estudio de marcadores de superficie específicos de CM (CD73, CD90 y CD105) por citometría de flujo, obteniéndose porcentajes similares en ambos tratamientos: CD73 99.2%; CD90 85.5% y CD105 62.01%. Previo al procesamiento, se observó morfológicamente la pulpa dental mediante MET, destacándose la presencia de células de morfología variable, con signos que indican una intensa actividad metabólica. Se evidencian mitocondrias en todas las células, gran cantidad de vesículas y gránulos de secreción. Las células cultivadas fueron analizadas mediante microscopía con contraste de fases, y se observó la formación de numerosas colonias de células fusiformes y estrelladas, formando agregados en forma irradiada, paralelas unas a otras. Para el tratamiento 1, se alcanzó confluencia celular luego de 21 días de cultivo. En cambio, para el tratamiento 2 el crecimiento fue más rápido y se alcanzó el estado de semiconfluencia a los 14 días. Con estos resultados preliminares podemos concluir que el explante es el mejor método para obtener CM mesenquimales derivadas de los tejidos dentales, ya que se obtiene mayor número de células en menor tiempo, lo que es coincidente con la bibliografía publicada al respecto. Además, la morfología celular es un buen indicador de calidad y desarrollo del cultivo, pudiendo utilizarse como control de calidad biológico en este tipo de procedimientos.The presence of stem cellsln dental tissues opened new lines of research In the regenerative dentistry area. The objectives of this work were to develop and characterize a method for obtaining, isolating and expanding dental tissues derived stem cells. Third molars were used, which pulps and periodontal sac were processed using one of these two methods: 1) enzymatic digestion 2) explants. In both cases, the obtained cells were cultured in supplemented DMEM. The cells were characterized In stage P2 (passage 2) by studying specific surface markers of stem cells(CD73, CD90 and CD105) by flow cytometry, obtaining similar percentages in both treatments: CD73 99.2%; CD90 85.5% and CD105 62.01%. Prior to processing, dental pulp was morphologically analyzed by MET, highlighting the presence of cells with variable morphology, with signs Indicating Intense metabolic activity. Mitochondria, large amount of vesicles and secretion granulesare evidenced in all cells. Cultured cells were analyzed through contrast phase microscopy, the formation of numerous spindle and stellate cells colonies were observed, forming aggregates In irradiated form, parallel to one another. For treatment 1, cell confluence was reached after 21 days of culture. On the other hand, for treatment 2, the growth was faster and the state of semi confluence was reached after 14 days. With these preliminary results we can conclude that the explant is the best method to obtain stem cells derived from dental tissues, since a greater number of cells Is obtained in less time, which coincides with the published literature. In addition, cell morphology Is a good Indicator of culture quality and development, and can be used as a biological quality control in this type of procedure.Facultad de Odontología (FOLP

Setting up of the process of expansion of dental tissue derived cells

La presencia de células madre (CM) en tejidos dentales abrió nuevas líneas de investigación en el área de la odontología regenerativa. Los objetivos de este trabajo fueron poner a punto el método de obtención, aislamiento y expansión de CM derivadas de tejidos dentales y caracterizarlas. Se utilizaron terceros molares cuyas pulpas y saco periodontal se procesaron de la siguiente manera: 1) digestión enzimática; 2) obtención de explantes. En ambos casos, se cultivaron en DMEM suplementado. Las células fueron caracterizadas en el estadio P2 (pasaje 2) mediante el estudio de marcadores de superficie específicos de CM (CD73, CD90 y CD105) por citometría de flujo, obteniéndose porcentajes similares en ambos tratamientos: CD73 99.2%; CD90 85.5% y CD105 62.01%. Previo al procesamiento, se observó morfológicamente la pulpa dental mediante MET, destacándose la presencia de células de morfología variable, con signos que indican una intensa actividad metabólica. Se evidencian mitocondrias en todas las células, gran cantidad de vesículas y gránulos de secreción. Las células cultivadas fueron analizadas mediante microscopía con contraste de fases, y se observó la formación de numerosas colonias de células fusiformes y estrelladas, formando agregados en forma irradiada, paralelas unas a otras. Para el tratamiento 1, se alcanzó confluencia celular luego de 21 días de cultivo. En cambio, para el tratamiento 2 el crecimiento fue más rápido y se alcanzó el estado de semiconfluencia a los 14 días. Con estos resultados preliminares podemos concluir que el explante es el mejor método para obtener CM mesenquimales derivadas de los tejidos dentales, ya que se obtiene mayor número de células en menor tiempo, lo que es coincidente con la bibliografía publicada al respecto. Además, la morfología celular es un buen indicador de calidad y desarrollo del cultivo, pudiendo utilizarse como control de calidad biológico en este tipo de procedimientos.The presence of stem cellsln dental tissues opened new lines of research In the regenerative dentistry area. The objectives of this work were to develop and characterize a method for obtaining, isolating and expanding dental tissues derived stem cells. Third molars were used, which pulps and periodontal sac were processed using one of these two methods: 1) enzymatic digestion 2) explants. In both cases, the obtained cells were cultured in supplemented DMEM. The cells were characterized In stage P2 (passage 2) by studying specific surface markers of stem cells(CD73, CD90 and CD105) by flow cytometry, obtaining similar percentages in both treatments: CD73 99.2%; CD90 85.5% and CD105 62.01%. Prior to processing, dental pulp was morphologically analyzed by MET, highlighting the presence of cells with variable morphology, with signs Indicating Intense metabolic activity. Mitochondria, large amount of vesicles and secretion granulesare evidenced in all cells. Cultured cells were analyzed through contrast phase microscopy, the formation of numerous spindle and stellate cells colonies were observed, forming aggregates In irradiated form, parallel to one another. For treatment 1, cell confluence was reached after 21 days of culture. On the other hand, for treatment 2, the growth was faster and the state of semi confluence was reached after 14 days. With these preliminary results we can conclude that the explant is the best method to obtain stem cells derived from dental tissues, since a greater number of cells Is obtained in less time, which coincides with the published literature. In addition, cell morphology Is a good Indicator of culture quality and development, and can be used as a biological quality control in this type of procedure.Facultad de Odontología (FOLP

Stress-induced Gene Expression Sensing Intracellular Heating Triggered by Magnetic Hyperthermia

It is known that alternating magnetic field applications on eukaryotic cells loaded with single domain iron oxide nanoparticles result in high hyperthermic citotoxicity leading to cell dead. Although magnetic hyperthermia therapy for cancer tumours is being developed under this idea, some in vitro assays have shown controversial results indicating that alternating magnetic field triggers large apoptotic effect without significant culture-temperature increase. In agreement with these observations a huge lowering in nanoparticle specific heating rates, when going from the colloidal suspension to cell endosomes, together with cell death, has been reported. Here, we propose a new methodology to determine the occurrence of local heating in cells when alternating magnetic fields in the radiofrequency field range are applied to cell cultures holding very low iron oxide concentrations, being these concentrations insufficient to produce a global cell-culture temperature increase up to therapeutic values. To this end, human lung adenocarcinoma cells (A549 cell line) were transduced with a lentiviral vector encoding the expression of the enhanced green fluorescence protein, EGFP, under the action of the inducible human heat shock protein 70B promoter. This modified A549 cell line was incubated with aqueous suspensions of magnetite core nanoparticles (uncoated or covered with coating agents like citric acid or silicon oxide), and exposed to radiofrequency fields. The application of an alternating magnetic field to cell cultures loaded with nanoparticles resulted in no global temperature increase but EGFP expression. Stress-inducible gene expression scales with uptake and nanoparticle properties like saturation magnetization and heat dissipation efficiency. Our analysis demonstrates that EGFP expression is linked to a localized intracellular temperature increase.Facultad de Ciencias ExactasInstituto de Física La PlataFacultad de Ciencias MédicasInstituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plat

Morphological and phenotypic comparison between human stem cells from dental pulp and dental sac

Objetivo: Las piezas dentarias son una fuente importante decélulas madres. Se pueden obtener de diferentes tejidos dentales (pulpa, saco, ligamento periodontal). El objetivo de este trabajo fue comparar las características fenotípicas y morfológicas de las células madre mesenquimales aisladas de la pulpa dental y el saco dental.Se obtuvieron tres muestras de tejido de pulpa y tres muestras de tejido de saco de terceros molares indicados para exodoncia. Las células aisladas se cultivaron en iguales condiciones y se caracterizaron mediante microscopía de contraste de fases, MET y citometría de flujo, utilizando marcadores CD73, CD90 y CD105. Se observaron células fusiformes y estrelladas con morfología similar a fibroblastos y disposición paralela. Células cuboides fueron encontradas en los cultivos derivados de saco. Resultados similares fueron obtenidos por citometría de flujo en ambas poblaciones. Estos resultados preliminares confirman que las células madre de ambos tejidos dentales tienen características similares.Dental pieces are an important source of mesenchymal stem cells. They can be obtained from different dental tissues (pulp, sac, periodontal ligament). The aim of this research wasto compare phenotypic and morphological characteristics of stem cells isolated from dental pulp and dental sac. Three samples of pulp tissue and three samples of sac tissue were obtained from third molars indicated for exodontia. The isolated cells were cultured under the same conditions, and characterized by phase contrast microscopy, MET and flowcytometry, using CD73, CD 90 and CD105 markers. Fusiform and stellate cells were observed, with fibroblast likeshape and parallel arrangement. Cuboids like cells were found in sac tissue derived cultures. Similar results were obtained by Flow cytometry in both populations.These preliminary results confirm that stem cells from bot h dental tissues have similar characteristics.Facultad de Odontologí

Morphological and phenotypic comparison between human stem cells from dental pulp and dental sac

Objetivo: Las piezas dentarias son una fuente importante decélulas madres. Se pueden obtener de diferentes tejidos dentales (pulpa, saco, ligamento periodontal). El objetivo de este trabajo fue comparar las características fenotípicas y morfológicas de las células madre mesenquimales aisladas de la pulpa dental y el saco dental.Se obtuvieron tres muestras de tejido de pulpa y tres muestras de tejido de saco de terceros molares indicados para exodoncia. Las células aisladas se cultivaron en iguales condiciones y se caracterizaron mediante microscopía de contraste de fases, MET y citometría de flujo, utilizando marcadores CD73, CD90 y CD105. Se observaron células fusiformes y estrelladas con morfología similar a fibroblastos y disposición paralela. Células cuboides fueron encontradas en los cultivos derivados de saco. Resultados similares fueron obtenidos por citometría de flujo en ambas poblaciones. Estos resultados preliminares confirman que las células madre de ambos tejidos dentales tienen características similares.Dental pieces are an important source of mesenchymal stem cells. They can be obtained from different dental tissues (pulp, sac, periodontal ligament). The aim of this research wasto compare phenotypic and morphological characteristics of stem cells isolated from dental pulp and dental sac. Three samples of pulp tissue and three samples of sac tissue were obtained from third molars indicated for exodontia. The isolated cells were cultured under the same conditions, and characterized by phase contrast microscopy, MET and flowcytometry, using CD73, CD 90 and CD105 markers. Fusiform and stellate cells were observed, with fibroblast likeshape and parallel arrangement. Cuboids like cells were found in sac tissue derived cultures. Similar results were obtained by Flow cytometry in both populations.These preliminary results confirm that stem cells from bot h dental tissues have similar characteristics.Facultad de Odontologí

Morphological and phenotypic comparison between human stem cells from dental pulp and dental sac

Objetivo: Las piezas dentarias son una fuente importante decélulas madres. Se pueden obtener de diferentes tejidos dentales (pulpa, saco, ligamento periodontal). El objetivo de este trabajo fue comparar las características fenotípicas y morfológicas de las células madre mesenquimales aisladas de la pulpa dental y el saco dental.Se obtuvieron tres muestras de tejido de pulpa y tres muestras de tejido de saco de terceros molares indicados para exodoncia. Las células aisladas se cultivaron en iguales condiciones y se caracterizaron mediante microscopía de contraste de fases, MET y citometría de flujo, utilizando marcadores CD73, CD90 y CD105. Se observaron células fusiformes y estrelladas con morfología similar a fibroblastos y disposición paralela. Células cuboides fueron encontradas en los cultivos derivados de saco. Resultados similares fueron obtenidos por citometría de flujo en ambas poblaciones. Estos resultados preliminares confirman que las células madre de ambos tejidos dentales tienen características similares.Dental pieces are an important source of mesenchymal stem cells. They can be obtained from different dental tissues (pulp, sac, periodontal ligament). The aim of this research wasto compare phenotypic and morphological characteristics of stem cells isolated from dental pulp and dental sac. Three samples of pulp tissue and three samples of sac tissue were obtained from third molars indicated for exodontia. The isolated cells were cultured under the same conditions, and characterized by phase contrast microscopy, MET and flowcytometry, using CD73, CD 90 and CD105 markers. Fusiform and stellate cells were observed, with fibroblast likeshape and parallel arrangement. Cuboids like cells were found in sac tissue derived cultures. Similar results were obtained by Flow cytometry in both populations.These preliminary results confirm that stem cells from bot h dental tissues have similar characteristics.Facultad de Odontologí

Diferentes técnicas de cultivo de células madre pulpares y bioestimulación con láser

OBJETIVOS: Comparar el crecimiento y desarrollo de células madre pulpares empleando dos metodologías diferentes. Estudiar el efecto de la bioestimulación con láser. MÉTODOS: El material biológico fue obtenido de terceros molares retenidos extraídos en el Centro de Alta Complejidad de la Facultad de Odontología La Plata, según protocolo de investigación aprobado por el Comité de Bioética. Cada pieza fue sumergida en medio de transporte con antibióticos y llevada al Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la FOLP. Allí se separaron coronas de raíces con cincel y se extrajeron las pulpas con cureta. Las mismas fueron distribuidas en dos grupos. Las del grupo 1 (6 pulpas) fueron procesadas como explantos: se cortaron en pequeños trozos y colocaron en placas de Petri plásticas de 3.5 cm de diámetro agregándose medio de cultivo DMEM suplementado con Suero Fetal Bovino y antibióticos. Las del grupo 2 (3 pulpas), fueron incubadas en solución de colagenasa durante 60 minutos a 37° y cultivadas en las mismas condiciones que el grupo 1. El ensayo de bioestimulación con laser se realizó sobre células derivadas del grupo 1 con dos densidades de energía distintas: 1.8 J/cm2 y 3.6 J/cm2. El control de proliferación se realizó a las 48 hs con microscopio invertido y el conteo celular con cámara de Neubauer.Facultad de Odontologí

Células madres pulpares: describiendo y descubriendo potencialidades

La evidencia científica ha demostrado que las células madre (CM) ofrecen una importante innovación en la investigación odontológica. Ellas pueden diferenciarse posibilitando el reemplazo de tejidos afectados aunque sean de otros linajes celulares. Las de origen dental por su multipotencialidad pueden formar células con carácter osteo/odontogénico, adipogénico y neurogénico. La pulpa dental ofrece células madre en baja concentración, siendo más proliferativas aquellas que dan origen a la corona o las procedentes de dientes neonatales; una subpoblación de estas puede diferenciarse hacia osteoblastos o células endoteliales. Los dientes temporales exfoliados son una sustancial fuente de células madre pulpares, poseen células epiteliales para la regeneración dentaria, así como angiogénicas precursoras de tejido conectivo. Las células madre de la papila dental controlan las fases eruptivas y de formación dental mediante la interacción molecular. En consecuencia las CM pulpares son: de fácil acceso al lugar donde se encuentran, de escasa morbilidad, de extraeción altamente eficiente, con gran capacidad de diferenciación, y su demostrada interacción con biomateriales las hace ideales para la regeneración tisular.Los trabajos de investigación revistos son el pilar fundamental para desarrollar nuevos tratamientos en el futuro basados en células madres, que tendrán aplicación en la práctica clínica odontológica.Scientific evidence has shown that stem cells (SC) provide an important innovation in dental research. They can be differentiated allowing replacement of affected tissue even of other cell lines. The dental origin for its multipotentiality can form cells with osteo/odontogenic, adipogenic and neurogenic character. It provides dental pulp stem cells in low concentration, being proliferative those that give rise to the crown or from neonatal teeth; A subpopulation of these can differentiate into osteoblasts or endothelial cells. Exfoliated deciduous teeth are a substantial source of pulp stem cells possesses epithelial cells for tooth regeneration, as well as angiogenic precursor of connective tissue. Stem cells control the dental papilla and dental eruptive phase formation by molecular interaction. Thus the CM pulp are easily accessible to the place where they are, of low morbidity, highly efhcient extraction, with plenty of differentiation, and demonstrated interaction with bioma- terials makes them ideal for regeneration tisular. The reviews are the key to developing new treatments in the future based on stem cells that will have application in dental clinical practice pillar.Facultad de Odontologí

Células madres pulpares: describiendo y descubriendo potencialidades

La evidencia científica ha demostrado que las células madre (CM) ofrecen una importante innovación en la investigación odontológica. Ellas pueden diferenciarse posibilitando el reemplazo de tejidos afectados aunque sean de otros linajes celulares. Las de origen dental por su multipotencialidad pueden formar células con carácter osteo/odontogénico, adipogénico y neurogénico. La pulpa dental ofrece células madre en baja concentración, siendo más proliferativas aquellas que dan origen a la corona o las procedentes de dientes neonatales; una subpoblación de estas puede diferenciarse hacia osteoblastos o células endoteliales. Los dientes temporales exfoliados son una sustancial fuente de células madre pulpares, poseen células epiteliales para la regeneración dentaria, así como angiogénicas precursoras de tejido conectivo. Las células madre de la papila dental controlan las fases eruptivas y de formación dental mediante la interacción molecular. En consecuencia las CM pulpares son: de fácil acceso al lugar donde se encuentran, de escasa morbilidad, de extraeción altamente eficiente, con gran capacidad de diferenciación, y su demostrada interacción con biomateriales las hace ideales para la regeneración tisular.Los trabajos de investigación revistos son el pilar fundamental para desarrollar nuevos tratamientos en el futuro basados en células madres, que tendrán aplicación en la práctica clínica odontológica.Scientific evidence has shown that stem cells (SC) provide an important innovation in dental research. They can be differentiated allowing replacement of affected tissue even of other cell lines. The dental origin for its multipotentiality can form cells with osteo/odontogenic, adipogenic and neurogenic character. It provides dental pulp stem cells in low concentration, being proliferative those that give rise to the crown or from neonatal teeth; A subpopulation of these can differentiate into osteoblasts or endothelial cells. Exfoliated deciduous teeth are a substantial source of pulp stem cells possesses epithelial cells for tooth regeneration, as well as angiogenic precursor of connective tissue. Stem cells control the dental papilla and dental eruptive phase formation by molecular interaction. Thus the CM pulp are easily accessible to the place where they are, of low morbidity, highly efhcient extraction, with plenty of differentiation, and demonstrated interaction with bioma- terials makes them ideal for regeneration tisular. The reviews are the key to developing new treatments in the future based on stem cells that will have application in dental clinical practice pillar.Facultad de Odontologí

Diferentes técnicas de cultivo de células madre pulpares y bioestimulación con láser

OBJETIVOS: Comparar el crecimiento y desarrollo de células madre pulpares empleando dos metodologías diferentes. Estudiar el efecto de la bioestimulación con láser. MÉTODOS: El material biológico fue obtenido de terceros molares retenidos extraídos en el Centro de Alta Complejidad de la Facultad de Odontología La Plata, según protocolo de investigación aprobado por el Comité de Bioética. Cada pieza fue sumergida en medio de transporte con antibióticos y llevada al Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la FOLP. Allí se separaron coronas de raíces con cincel y se extrajeron las pulpas con cureta. Las mismas fueron distribuidas en dos grupos. Las del grupo 1 (6 pulpas) fueron procesadas como explantos: se cortaron en pequeños trozos y colocaron en placas de Petri plásticas de 3.5 cm de diámetro agregándose medio de cultivo DMEM suplementado con Suero Fetal Bovino y antibióticos. Las del grupo 2 (3 pulpas), fueron incubadas en solución de colagenasa durante 60 minutos a 37° y cultivadas en las mismas condiciones que el grupo 1. El ensayo de bioestimulación con laser se realizó sobre células derivadas del grupo 1 con dos densidades de energía distintas: 1.8 J/cm2 y 3.6 J/cm2. El control de proliferación se realizó a las 48 hs con microscopio invertido y el conteo celular con cámara de Neubauer.Facultad de Odontologí