93 research outputs found
MATHEMATICAL MODELING OF MOLECULAR TRANSMEMBRANE TRANSPORT AND CHANGES OF TISSUESĀ“ DIELECTRIC PROPERTIES DUE TO ELECTROPORATION
Visokonapetostni elektriÄni pulzi poveÄajo prepustnost celiÄne membrane (Tsong 1991Weaver 1993Kotnik et al. 2012) skozi pore (Abidor et al. 1979), ki nastanejo na tistih njenih delih, kjer vsiljena
transmembranska napetost preseže kritiÄno vrednost (Towhidi et al. 2008Kotnik et al. 2010).
Elektroporacija je reverzibilna, Äe si celica po pulzih opomore, in ireverzibilna, Äe je Å”koda preobsežna in
celica odmre (Pakhomova et al. 2013bJiang et al. 2015a). Trenutne optiÄne metode por ne morejo zaznati,
zato njihov nastanek zaznavamo posredno, bodisi z meritvami vnosa razliÄnih molekul v celice ali z
meritvami elektriÄnih lastnosti celic (Napotnik in MiklavÄiÄ 2017).
Uporaba elektroporacije
V živilski industriji (Toepfl 2012Toepfl et al. 2014) uporabljamo elektroporacijo oziroma pulzirajoÄa
elektriÄna polja (angl. pulsed electric fields), kar je uveljavljen izraz v tej industriji, za uniÄevanje patogenih
organizmov in njihovih produktov (encimov in toksinov). V nasprotju s termiÄno obdelavo hrane elektriÄni
pulzi ne vplivajo na okus, barvo ali hranilno vrednost. V biotehnologiji uporabljamo elektroporacijo za
ekstrakcijo molekul iz mikroorganizmov in rastlin, s Äimer se izognemo uporabi kemiÄnih sredstev in ne
uniÄimo celiÄnih organelov, torej se izognemo tudi dodatnemu ÄiÅ”Äenju konÄnega produkta (Sack et al.
2010Haberl et al. 2013aMahniÄ-Kalamiza et al. 2014bKotnik et al. 2015). Primeri: ekstrakcija DNK iz
bakterijsladkorja iz sladkorne pese (Haberl et al. 2013b), sokov iz sadjapolifenolov iz grozdja za
izboljÅ”anje kvalitete vina (PuĆ©rtolas et al. 2010)vode pri suÅ”enju zelene biomase, ki služi kot vir za
biogorivo (Golberg et al. 2016). Elektroporacija je tudi nova metoda pri zamrzovanju celic in tkiv, angl.
cryopreservation (Galindo in Dymek 2016Dovgan et al. 2017).
Elektroporacijo uporabljamo tudi v medicini (MiklavÄiÄ et al. 2010Yarmush et al. 2014), in sicer pri
elektrokemoterapiji (MiklavÄiÄ et al. 2012Mali et al. 2013Cadossi et al. 2014MiklavÄiÄ et al. 2014Campana et al. 2014SerÅ”a et al. 2015), netermiÄnem odstranjevanju tkiva z ireverzibilno elektroporacijo
(Davalos et al. 2005Garcia et al. 2010JosƩ et al. 2012Cannon et al. 2013Scheffer et al. 2014bJiang et
al. 2015aRossmeisl et al. 2015), genski terapiji (Golzio et al. 2002Vasan et al. 2011Gothelf in Gehl
2012Calvet et al. 2014Heller in Heller 2015Trimble et al. 2015) in vnosu uÄinkovin v kožo in skoznjo
(Denet et al. 2004Zorec et al. 2013b). Pri genski terapiji vnesemo v celice plazmide, v katerih je zapisana
sinteza doloÄenega proteina, ki lahko spremeni bioloÅ”ko funkcijo celice (Aihara in Miyazaki 1998Heller in
Heller 2015). Z elektroporacijo poviŔamo varnost genske terapije, saj se izognemo uporabi virusov in
kemikalij. Mehanizmi genske terapije z elektroporacijo Ŕe niso popolnoma pojasnjeni, osnovni koraki so
opisani v literaturi (Rosazza et al. 2016). Z elektroporacijo lahko zlivamo razliÄne celice, s Äimer
pridobivamo celice, ki proizvajajo monoklonska protitelesa ali inzulin (Ramos in TeissiƩ 2000Trontelj et
al. 2008Rems et al. 2013).
V doktorski disertaciji sem se osredotoÄila na uporabo elektroporacije v medicini, predvsem pri
elektrokemoterapiji, netermiÄnem odstranjevanju tkiva z ireverzibilno elektroporacijo in pri vnosu
uÄinkovin v kožo in skoznjo je, zato so ti trije posegi podrobneje opisani v naslednjem poglavju.
Medicinski posegi z elektroporacijo ā elektrokemoterapija, netermiÄno odstranjevanje tkiva z
ireverzibilno elektroporacijo in vnos uÄinkovin v kožo in skoznjo
Elektrokemoterapija je kombinacija kemoterapije in elektriÄnih pulzov, dovedenih neposredno na tarÄno
tkivo. ElektriÄni pulzi poveÄajo prepustnost celiÄne membrane za kemoterapevtike, zato poveÄamo
uÄinkovitost zdravljenja, obenem pa zmanjÅ”amo dovedeno dozo kemoterapevtika in omilimo stranske
uÄinke. Celoten tumor mora biti pokrit z dovolj visokim elektriÄnim poljem, da poveÄamo prepustnost vseh
tumorskih celic (MiklavÄiÄ et al. 2006a), zagotoviti pa moramo tudi dovolj visoko koncentracijo
kemoterapevtika znotraj tumorja (MiklavÄiÄ et al. 2014). OkoliÅ”ko tkivo ne sme biti uniÄeno, torej mora biti
elektriÄno polje okoli tumorja pod mejo za ireverzibilno elektroporacijo. Pri elektrokemoterapiji obiÄajno
dovajamo osem pulzov dolžine 100 Ī¼s s ponavljalno frekvenco 1 Hz. S poskusi doloÄena meja za poviÅ”anje
prepustnosti tumorskega tkiva je 0,4 kV/cm (MiklavÄiÄ et al. 2010). Osem pulzov je bilo doloÄenih kot
optimalno Å”tevilo pulzov (Marty et al. 2006Mir et al. 2006), veÄje Å”tevilo dovedenih pulzov namreÄ Å¾e
zmanjÅ”uje preživetje (Dermol in MiklavÄiÄ 2015). Za zdravljenje tumorjev z elektrokemoterapijo so bili
definirani standardni postopki (angl. standard operating procedures) (Marty et al. 2006Mir et al. 2006),
kjer so glede na Å”tevilo tumorjev, njihovo velikost in lokacijo (na koži ali pod kožo) doloÄeni tip elektrod,
kemoterapevtik, anestezija in naÄin dovajanja kemoterapevtika. Kemoterapevtik lahko dovedemo lokalno
ali sistemsko. V elektrokemoterapiji oz. terapiji z elektriÄnimi pulzi sta najbolj razÅ”irjena kemoterapevtika
cisplatin in bleomicin. Z elektrokemoterapijo je možno zdraviti tudi globlje ležeÄe tumorje (MiklavÄiÄ et al.
2010Pavliha et al. 2013EdhemoviÄ et al. 2014MiklavÄiÄ in Davalos 2015). V zadnjem Äasu se
uveljavlja tudi uniÄevanje tumorskih celic z visokimi koncentracijami kalcija in elektriÄnimi pulzi
(Frandsen et al. 2015Frandsen et al. 2016Frandsen et al. 2017). Pri elektrokemoterapiji se pojavijo Ŕe
dodatni uÄinki, ki poviÅ”ajo uÄinkovitost elektroporacije. Vazokonstrikcija zmanjÅ”a spiranje kemoterapevtika
iz tumorja in s tem ohranja visoko koncentracijo kemoterapevtika v tumorju, obenem se zmanjŔa pretok
krvi skozi tumor, kar povzroÄi hipoksijo in pomanjkanje hranilnih snovi (Mir 2006SerÅ”a et al. 2008).
Elektrokemoterapija sproži tudi odziv imunskega sistema, ki nato odstrani preostale tumorske celice (SerŔa
et al. 2015).
Z ireverzibilno elektroporacijo netermiÄno odstranjujemo tumorje brez uporabe kemoterapevtika (Jiang et
al. 2015a). Tako se popolnoma izognemo stranskim uÄinkom kemoterapevtikov, vendar na raÄun veÄ
dovedene energije in poslediÄno Joulovega gretja. Pri ireverzibilni elektroporaciji dovajamo veÄ (okoli 90)
elektriÄnih pulzov, dolgih od 50 Ī¼s do 100 Ī¼s, s ponavljalno frekvenco 1 Hz. Dovedeno elektriÄno polje je v
rangu nekaj kV/cm, kar je dosti veÄ kot pri elektrokemoterapiji. Pri ireverzibilni elektroporaciji lahko z
visoko natanÄnostjo odstranimo želeno tkivo ā obmoÄje med uniÄenim in nepoÅ”kodovanim tkivom je Å”iroko
le nekaj premerov celic (Rubinsky et al. 2007). Za odstranjevanje tumorjev tradicionalno uporabljamo
termiÄne metode (Hall et al. 2014) ā radiofrekvenÄno odstranjevanje in odstranjevanje s tekoÄim duÅ”ikom,
kjer tkivo uniÄujemo z visoko oz. z nizko temperaturo. Prednost ireverzibilne elektroporacije pred
uveljavljenimi termiÄnimi metodami je krajÅ”i Äas zdravljenja, izognemo se uÄinkom hlajenja oz. gretja tkiva
zaradi bližine žil (Golberg et al. 2015), pri Äemer ostanejo okoliÅ”ke pomembne strukture (žile, živci)
nedotaknjene (Jiang et al. 2015a). Tudi pri ireverzibilni elektroporaciji je v dokonÄno odstranitev tumorskih
celic vpleten imunski sistem (Neal et al. 2013).
Pri elektrokemoterapiji in ireverzibilni elektroporaciji se zaradi daljŔih pulzov in ponavljalne frekvence
1 Hz pojavljajo težave zaradi krÄenja miÅ”ic (MiklavÄiÄ et al. 2005), boleÄine med dovajanjem pulzov,
heterogenosti elektriÄnih lastnosti tkiv v tem frekvenÄnem podroÄju ter zaradi možnosti srÄnih aritmij (Ball
et al. 2010). BoleÄini in krÄenju miÅ”ic se lahko izognemo, Äe pulze dovajamo z viÅ”jo frekvenco, npr. 5 kHz
(ŽupaniÄ et al. 2007SerÅ”a et al. 2010). SrÄnim aritmijam se izognemo tako, da s sinhroniziramo dovedene
elektriÄne pulze z elektriÄno aktivnostjo srÄne miÅ”ice (Mali et al. 2008Deodhar et al. 2011aMali et al.
2015). BoleÄini, krÄenju miÅ”ic in heterogenosti elektriÄnih lastnosti tkiv se lahko izognemo z dovajanjem
1 Ī¼s bipolarnih pulzov (Arena et al. 2011Arena in Davalos 2012Sano et al. 2015). V zadnjem Äasu so se
pojavile tudi metode, s katerimi so vnos barvil v celico dosegli brezkontaktno s t. i. magnetoporacijo (Chen
et al. 2010Towhidi et al. 2012Kardos in Rabussay 2012Novickij et al. 2015Kranjc et al. 2016Novickij et al. 2017bNovickij et al. 2017a).
Elektroporacijo lahko uporabljamo ne le za zdravljenje tumorjev, temveÄ tudi za vnos uÄinkovin v kožo in
skoznjo. Vnos uÄinkovin skozi kožo je neinvaziven, poleg tega pa se izognemo degradaciji uÄinkovin pri
prehodu skozi prebavni trakt. Skozi kožo lahko preide le malo molekul, zato uporabljamo razliÄne metode
za poveÄanje prehoda uÄinkovin ā iontoforezo, radiofrekvenÄno mikroablacijo, laser, mikroigle, ultrazvok
in elektroporacijo (Zorec et al. 2013b). Proces elektroporacije kože je slabo razumljen. Predpostavljamo, da
pri dovajanju visokonapetostnih elektriÄnih pulzov v roženi plasti nastanejo lokalna transportna obmoÄja,
kjer sta poviÅ”ani elektriÄna prevodnost in prepustnost (Pliquett et al. 1996Pliquett et al. 1998Pliquett et
al. 1998PavÅ”elj in MiklavÄiÄ 2008a). Skozi lokalna transportna obmoÄja lahko nato uÄinkovine Å”e nekaj ur
po dovedenih pulzih vstopajo skozi kožo v krvni obtok (Zorec et al. 2013a). Gostota teh obmoÄij je odvisna
od elektriÄnega polja v koži ā viÅ”je elektriÄno polje jih povzroÄi veÄ. Velikost lokalnih transportnih obmoÄij
je odvisna od trajanja pulza. Med samim pulzom se zaradi Joulovega gretja topijo lipidi v roženi plasti, kar
povzroÄi njihovo Å”irjenje (Pliquett et al. 1996Prausnitz et al. 1996Pliquett et al. 1998Weaver et al. 1999Vanbever et al. 1999Gowrishankar et al. 1999b).
NaÄrtovanje posegov elektrokemoterapije in netermiÄnega odstranjevanja tkiva z ireverzibilno
elektroporacijo
Pri zdravljenju tumorjev z elektroporacijo lahko uporabimo standardne oblike in postavitve elektrod z že
doloÄenimi parametri elektriÄnih pulzov (Marty et al. 2006Mir et al. 2006Campana et al. 2014). Äe
zdravimo velike tumorje ali tumorje nepravilnih oblik, ki pogosto ležijo globlje, s standardno postavitvijo
elektrod ne moremo zagotoviti ustrezne pokritosti tumorja z dovolj visokim elektriÄnim poljem. V tem
primeru lahko elektrode med samim posegom veÄkrat premaknemo ali pa prilagodimo njihovo Å”tevilo in
postavitev. Pri tem moramo prej pripraviti naÄrt posega (Kos et al. 2010MiklavÄiÄ et al. 2010Pavliha et
al. 2012Linnert et al. 2012EdhemoviÄ et al. 2014). V njem zagotovimo, da bo cel tumor izpostavljen
dovolj visokemu elektriÄnemu polju (MiklavÄiÄ et al. 2006a), obenem pa Å”koda na okoliÅ”kem tkivu
minimalna.
NaÄrtovanje posega poteka v veÄ korakih: 1. zajem medicinskih slik (raÄunalniÅ”ka tomografija, magnetna
resonanca) tumorja in okoliÅ”kega tkiva2. obdelava slik3. razgradnja slik in doloÄitev geometrije tkiva4.
vzpostavitev tridimenzionalnega modela5. optimizacija postavitve elektrod glede na obliko in velikost
tumorja6. izdelava modela elektroporacije (izraÄun elektriÄnega polja in spremembe elektriÄne
prevodnosti tkiva)7. optimizacija napetosti med elektrodami in položaja elektrod (Pavliha et al. 2012). Na
sliki 1 lahko vidimo izraÄunano elektriÄno polje v tumorju in okoliÅ”kem tkivu pri eni izmed možnih
postavitev elektrod.Electroporation is a phenomenon, which occurs when short high voltage pulses are applied to cells and tissues
resulting in a transient increase in membrane permeability or cell death, presumably due to pore formation. If
cells recover after pulse application, this is reversible electroporation. If cells die, this is irreversible
electroporation. Electroporation is used in biotechnology for biocompound extraction and cryopreservation, in
food processing for sterilization and pasteurization of liquid food and in medicine for treating tumors by
electrochemotherapy or irreversible electroporation as an ablation technique, for gene electrotransfer,
transdermal drug delivery, DNA vaccination, and cell fusion.
In electroporation-based medical treatments, we can treat tumors with predefined electrode geometry and
parameters of electric pulses. When we treat larger tumors of irregular shape treatment plan of the position of the
electrodes and parameters of the electric pulses has to be calculated before each treatment to assure coverage of
the tumor with a sufficient electric field. In treatment plans, currently, 1) we assume that above an
experimentally determined critical electric field all cells are affected and below not, although, in reality, the
transition between non-electroporated and electroporated state is continuous. 2) We do not take into account the
excitability of some tissues. 3) The increase in tissuesā conductivity is described phenomenologically and does
not include mechanisms of electroporation. 4) Transport of chemotherapeutics into the tumor cells in
electrochemotherapy treatments is not included in the treatment plan although it is vital for a successful
treatment. We focused on the mathematical and numerical models of electroporation with the aim of including
them in the treatment planning of electroporation-based medical treatments.
We aimed to model processes happening during electroporation of tissues, relevant in the clinical procedures, by
taking into account processes happening at the single cell level. First, we used mathematical models of cell
membrane permeability and cell death which are phenomenological descriptions of experimental data. The
models were chosen on the basis of the best fit with the experimental data. However, they did not include
mechanisms of electroporation, and their transferability to tissues was questionable. We modeled time dynamics
of dye uptake due to increased cell membrane permeability in several electroporation buffers with regard to the
electrosensitization, i.e., delayed hypersensitivity to electric pulses caused by pretreating cells with electric
pulses. We also modeled the strength-duration depolarization curve and cell membrane permeability curve of
excitable and non-excitable cell lines which could be used to optimize pulse parameters to achieve maximal drug
uptake at minimal tissue excitation.
Second, we modeled change in dielectric properties of tissues during electroporation. Model of change in
dielectric properties of tissues was built for skin and validated with current-voltage measurements. Dielectric
properties of separate layers of skin before electroporation were determined by taking into account geometric
and dielectric properties of single cells, i.e., keratinocytes, corneocytes. Dielectric properties of separate layers
during electroporation were obtained from cell-level models of pore formation on single cells of lower skin
layers (keratinocytes in epidermis and lipid spheres in papillary dermis) and local transport region formation in
the stratum corneum. Current-voltage measurements of long low-voltage pulses were accurately described taking
into account local transport region formation, pore formation in the cells of lower layers and electrode
polarization. Voltage measurements of short high-voltage pulses were also accurately described in a similar way
as with long low-voltage pulseshowever, the model underestimated the current, probably due to
electrochemical reactions taking place at the electrode-electrolyte interface.
Third, we modeled the transport of chemotherapeutics during electrochemotherapy in vivo. In
electrochemotherapy treatments, transport of chemotherapeutics in sufficient amounts into the cell is vital for a
successful treatment. We performed experiments in vitro and measured the intracellular platinum mass as a
function of pulse number and electric field by inductively coupled plasma ā mass spectrometry. Using the dualporosity
model, we calculated the in vitro permeability coefficient as a function of electric field and number of
applied pulses. The in vitro determined permeability coefficient was then used in the numerical model of mouse
melanoma tumor to describe the transport of cisplatin to the tumor cells. We took into account the differences in
the transport of cisplatin in vitro and in vivo caused by the decreased mobility of molecules and decreased
membrane area available for the uptake in vivo due to the high volume fraction of cells, the presence of cell
matrix and close cell connections. Our model accurately described the experimental results obtained in
electrochemotherapy of tumors and could be used to predict the efficiency of electrochemotherapy in vitro thus
reducing the number of needed animal experiments.
In the thesis, we connected the models at the cell level to the models at the tissue level with respect to cell
membrane permeability and depolarization, cell death, change in dielectric properties and transport.
Our models
offer a step forward in modeling and understanding electroporation at the tissue level. In future, our models
could be used to improve treatment planning of electroporation-based medical treatments
Proposal of a new research construct in female entrepreneurship
Entrepreneurship has been a gender-defined phenomenon for several decades. It has been presented as a typically male domain which for its demanding performance requires typical male characteristics. In this paper, we follow the suggestions of researchers of female entrepreneurs and focus on the research of three groups of female entrepreneurs. We propose that female entrepreneurs in different life stages have distinguished forms of human and social capital, and we apply the factors of those capitals to be measured. We observe the influence of parents, maternity as a metaphor for family involvement and family responsibilities, friends, and the broader environment on social capital. We discussed female entrepreneurship using two functions - as emotional support and incentives and as an instrumental social capital that provides access to information, resources and business partners. We added previous entrepreneurial experience, the level of education attained, business knowledge acquired at school and specific training, industry experience, previous managerial experience to the human capital function. With our model, we introduced the theory of life expectancy of women into entrepreneurship theory, which brings us closer to understanding the external influences on entrepreneurial aspirations and motivations of women of different ages
Exploiting multimedia technologies in education, research, and university-community projects
The pandemic has led to the acceleration of the digital transformation of all university activity. Some users/university staff were better prepared for this, but others need support and training in the development of digital skills. Increasing the efficiency and effectiveness of digitized activities (administrative, educational, research, university marketing, communication, and community involvement, with business or industrial partners) require increasing concerns for the university's human resources to have the necessary knowledge of operation. Moreover, our students are from generation Z, Millennials and can be stimulated in learning, interaction, and communication with the help of digital means, multimedia technologies and social media. We are witnessing a radical change in the way communication takes place in universities and within its extended community, with its various stakeholders. In this dynamic context we have built and present the way to extend the digital/multimedia competencies of university staff (administrative, teaching, research staff, etc.) with the support of an international community associated with the Erasmus+ project: āMultimedia Competencies for University Staff to Empower University - Community Collaborationsā (2020-1-RO01- KA203-080399)
MATEMATIÄNO MODELIRANJE SPREMEMB ELEKTRIÄNIH LASTNOSTI TKIV IN TRANSPORTA PREKO CELIÄNE MEMBRANE PRI ELEKTROPORACIJI
Electroporation is a phenomenon, which occurs when short high voltage pulses are applied to cells and tissues
resulting in a transient increase in membrane permeability or cell death, presumably due to pore formation. If
cells recover after pulse application, this is reversible electroporation. If cells die, this is irreversible
electroporation. Electroporation is used in biotechnology for biocompound extraction and cryopreservation, in
food processing for sterilization and pasteurization of liquid food and in medicine for treating tumors by
electrochemotherapy or irreversible electroporation as an ablation technique, for gene electrotransfer,
transdermal drug delivery, DNA vaccination, and cell fusion.
In electroporation-based medical treatments, we can treat tumors with predefined electrode geometry and
parameters of electric pulses. When we treat larger tumors of irregular shape treatment plan of the position of the
electrodes and parameters of the electric pulses has to be calculated before each treatment to assure coverage of
the tumor with a sufficient electric field. In treatment plans, currently, 1) we assume that above an
experimentally determined critical electric field all cells are affected and below not, although, in reality, the
transition between non-electroporated and electroporated state is continuous. 2) We do not take into account the
excitability of some tissues. 3) The increase in tissuesā conductivity is described phenomenologically and does
not include mechanisms of electroporation. 4) Transport of chemotherapeutics into the tumor cells in
electrochemotherapy treatments is not included in the treatment plan although it is vital for a successful
treatment. We focused on the mathematical and numerical models of electroporation with the aim of including
them in the treatment planning of electroporation-based medical treatments.
We aimed to model processes happening during electroporation of tissues, relevant in the clinical procedures, by
taking into account processes happening at the single cell level. First, we used mathematical models of cell
membrane permeability and cell death which are phenomenological descriptions of experimental data. The
models were chosen on the basis of the best fit with the experimental data. However, they did not include
mechanisms of electroporation, and their transferability to tissues was questionable. We modeled time dynamics
of dye uptake due to increased cell membrane permeability in several electroporation buffers with regard to the
electrosensitization, i.e., delayed hypersensitivity to electric pulses caused by pretreating cells with electric
pulses. We also modeled the strength-duration depolarization curve and cell membrane permeability curve of
excitable and non-excitable cell lines which could be used to optimize pulse parameters to achieve maximal drug
uptake at minimal tissue excitation.
Second, we modeled change in dielectric properties of tissues during electroporation. Model of change in
dielectric properties of tissues was built for skin and validated with current-voltage measurements. Dielectric
properties of separate layers of skin before electroporation were determined by taking into account geometric
and dielectric properties of single cells, i.e., keratinocytes, corneocytes. Dielectric properties of separate layers
during electroporation were obtained from cell-level models of pore formation on single cells of lower skin
layers (keratinocytes in epidermis and lipid spheres in papillary dermis) and local transport region formation in
the stratum corneum. Current-voltage measurements of long low-voltage pulses were accurately described taking
into account local transport region formation, pore formation in the cells of lower layers and electrode
polarization. Voltage measurements of short high-voltage pulses were also accurately described in a similar way
as with long low-voltage pulseshowever, the model underestimated the current, probably due to
electrochemical reactions taking place at the electrode-electrolyte interface.
Third, we modeled the transport of chemotherapeutics during electrochemotherapy in vivo. In
electrochemotherapy treatments, transport of chemotherapeutics in sufficient amounts into the cell is vital for a
successful treatment. We performed experiments in vitro and measured the intracellular platinum mass as a
function of pulse number and electric field by inductively coupled plasma ā mass spectrometry. Using the dualporosity
model, we calculated the in vitro permeability coefficient as a function of electric field and number of
applied pulses. The in vitro determined permeability coefficient was then used in the numerical model of mouse
melanoma tumor to describe the transport of cisplatin to the tumor cells. We took into account the differences in
the transport of cisplatin in vitro and in vivo caused by the decreased mobility of molecules and decreased
membrane area available for the uptake in vivo due to the high volume fraction of cells, the presence of cell
matrix and close cell connections. Our model accurately described the experimental results obtained in
electrochemotherapy of tumors and could be used to predict the efficiency of electrochemotherapy in vitro thus
reducing the number of needed animal experiments.
In the thesis, we connected the models at the cell level to the models at the tissue level with respect to cell
membrane permeability and depolarization, cell death, change in dielectric properties and transport.
Our models
offer a step forward in modeling and understanding electroporation at the tissue level. In future, our models
could be used to improve treatment planning of electroporation-based medical treatments.Visokonapetostni elektriÄni pulzi poveÄajo prepustnost celiÄne membrane (Tsong 1991Weaver 1993Kotnik et al. 2012) skozi pore (Abidor et al. 1979), ki nastanejo na tistih njenih delih, kjer vsiljena
transmembranska napetost preseže kritiÄno vrednost (Towhidi et al. 2008Kotnik et al. 2010).
Elektroporacija je reverzibilna, Äe si celica po pulzih opomore, in ireverzibilna, Äe je Å”koda preobsežna in
celica odmre (Pakhomova et al. 2013bJiang et al. 2015a). Trenutne optiÄne metode por ne morejo zaznati,
zato njihov nastanek zaznavamo posredno, bodisi z meritvami vnosa razliÄnih molekul v celice ali z
meritvami elektriÄnih lastnosti celic (Napotnik in MiklavÄiÄ 2017).
Uporaba elektroporacije
V živilski industriji (Toepfl 2012Toepfl et al. 2014) uporabljamo elektroporacijo oziroma pulzirajoÄa
elektriÄna polja (angl. pulsed electric fields), kar je uveljavljen izraz v tej industriji, za uniÄevanje patogenih
organizmov in njihovih produktov (encimov in toksinov). V nasprotju s termiÄno obdelavo hrane elektriÄni
pulzi ne vplivajo na okus, barvo ali hranilno vrednost. V biotehnologiji uporabljamo elektroporacijo za
ekstrakcijo molekul iz mikroorganizmov in rastlin, s Äimer se izognemo uporabi kemiÄnih sredstev in ne
uniÄimo celiÄnih organelov, torej se izognemo tudi dodatnemu ÄiÅ”Äenju konÄnega produkta (Sack et al.
2010Haberl et al. 2013aMahniÄ-Kalamiza et al. 2014bKotnik et al. 2015). Primeri: ekstrakcija DNK iz
bakterijsladkorja iz sladkorne pese (Haberl et al. 2013b), sokov iz sadjapolifenolov iz grozdja za
izboljÅ”anje kvalitete vina (PuĆ©rtolas et al. 2010)vode pri suÅ”enju zelene biomase, ki služi kot vir za
biogorivo (Golberg et al. 2016). Elektroporacija je tudi nova metoda pri zamrzovanju celic in tkiv, angl.
cryopreservation (Galindo in Dymek 2016Dovgan et al. 2017).
Elektroporacijo uporabljamo tudi v medicini (MiklavÄiÄ et al. 2010Yarmush et al. 2014), in sicer pri
elektrokemoterapiji (MiklavÄiÄ et al. 2012Mali et al. 2013Cadossi et al. 2014MiklavÄiÄ et al. 2014Campana et al. 2014SerÅ”a et al. 2015), netermiÄnem odstranjevanju tkiva z ireverzibilno elektroporacijo
(Davalos et al. 2005Garcia et al. 2010JosƩ et al. 2012Cannon et al. 2013Scheffer et al. 2014bJiang et
al. 2015aRossmeisl et al. 2015), genski terapiji (Golzio et al. 2002Vasan et al. 2011Gothelf in Gehl
2012Calvet et al. 2014Heller in Heller 2015Trimble et al. 2015) in vnosu uÄinkovin v kožo in skoznjo
(Denet et al. 2004Zorec et al. 2013b). Pri genski terapiji vnesemo v celice plazmide, v katerih je zapisana
sinteza doloÄenega proteina, ki lahko spremeni bioloÅ”ko funkcijo celice (Aihara in Miyazaki 1998Heller in
Heller 2015). Z elektroporacijo poviŔamo varnost genske terapije, saj se izognemo uporabi virusov in
kemikalij. Mehanizmi genske terapije z elektroporacijo Ŕe niso popolnoma pojasnjeni, osnovni koraki so
opisani v literaturi (Rosazza et al. 2016). Z elektroporacijo lahko zlivamo razliÄne celice, s Äimer
pridobivamo celice, ki proizvajajo monoklonska protitelesa ali inzulin (Ramos in TeissiƩ 2000Trontelj et
al. 2008Rems et al. 2013).
V doktorski disertaciji sem se osredotoÄila na uporabo elektroporacije v medicini, predvsem pri
elektrokemoterapiji, netermiÄnem odstranjevanju tkiva z ireverzibilno elektroporacijo in pri vnosu
uÄinkovin v kožo in skoznjo je, zato so ti trije posegi podrobneje opisani v naslednjem poglavju.
Medicinski posegi z elektroporacijo ā elektrokemoterapija, netermiÄno odstranjevanje tkiva z
ireverzibilno elektroporacijo in vnos uÄinkovin v kožo in skoznjo
Elektrokemoterapija je kombinacija kemoterapije in elektriÄnih pulzov, dovedenih neposredno na tarÄno
tkivo. ElektriÄni pulzi poveÄajo prepustnost celiÄne membrane za kemoterapevtike, zato poveÄamo
uÄinkovitost zdravljenja, obenem pa zmanjÅ”amo dovedeno dozo kemoterapevtika in omilimo stranske
uÄinke. Celoten tumor mora biti pokrit z dovolj visokim elektriÄnim poljem, da poveÄamo prepustnost vseh
tumorskih celic (MiklavÄiÄ et al. 2006a), zagotoviti pa moramo tudi dovolj visoko koncentracijo
kemoterapevtika znotraj tumorja (MiklavÄiÄ et al. 2014). OkoliÅ”ko tkivo ne sme biti uniÄeno, torej mora biti
elektriÄno polje okoli tumorja pod mejo za ireverzibilno elektroporacijo. Pri elektrokemoterapiji obiÄajno
dovajamo osem pulzov dolžine 100 Ī¼s s ponavljalno frekvenco 1 Hz. S poskusi doloÄena meja za poviÅ”anje
prepustnosti tumorskega tkiva je 0,4 kV/cm (MiklavÄiÄ et al. 2010). Osem pulzov je bilo doloÄenih kot
optimalno Å”tevilo pulzov (Marty et al. 2006Mir et al. 2006), veÄje Å”tevilo dovedenih pulzov namreÄ Å¾e
zmanjÅ”uje preživetje (Dermol in MiklavÄiÄ 2015). Za zdravljenje tumorjev z elektrokemoterapijo so bili
definirani standardni postopki (angl. standard operating procedures) (Marty et al. 2006Mir et al. 2006),
kjer so glede na Å”tevilo tumorjev, njihovo velikost in lokacijo (na koži ali pod kožo) doloÄeni tip elektrod,
kemoterapevtik, anestezija in naÄin dovajanja kemoterapevtika. Kemoterapevtik lahko dovedemo lokalno
ali sistemsko. V elektrokemoterapiji oz. terapiji z elektriÄnimi pulzi sta najbolj razÅ”irjena kemoterapevtika
cisplatin in bleomicin. Z elektrokemoterapijo je možno zdraviti tudi globlje ležeÄe tumorje (MiklavÄiÄ et al.
2010Pavliha et al. 2013EdhemoviÄ et al. 2014MiklavÄiÄ in Davalos 2015). V zadnjem Äasu se
uveljavlja tudi uniÄevanje tumorskih celic z visokimi koncentracijami kalcija in elektriÄnimi pulzi
(Frandsen et al. 2015Frandsen et al. 2016Frandsen et al. 2017). Pri elektrokemoterapiji se pojavijo Ŕe
dodatni uÄinki, ki poviÅ”ajo uÄinkovitost elektroporacije. Vazokonstrikcija zmanjÅ”a spiranje kemoterapevtika
iz tumorja in s tem ohranja visoko koncentracijo kemoterapevtika v tumorju, obenem se zmanjŔa pretok
krvi skozi tumor, kar povzroÄi hipoksijo in pomanjkanje hranilnih snovi (Mir 2006SerÅ”a et al. 2008).
Elektrokemoterapija sproži tudi odziv imunskega sistema, ki nato odstrani preostale tumorske celice (SerŔa
et al. 2015).
Z ireverzibilno elektroporacijo netermiÄno odstranjujemo tumorje brez uporabe kemoterapevtika (Jiang et
al. 2015a). Tako se popolnoma izognemo stranskim uÄinkom kemoterapevtikov, vendar na raÄun veÄ
dovedene energije in poslediÄno Joulovega gretja. Pri ireverzibilni elektroporaciji dovajamo veÄ (okoli 90)
elektriÄnih pulzov, dolgih od 50 Ī¼s do 100 Ī¼s, s ponavljalno frekvenco 1 Hz. Dovedeno elektriÄno polje je v
rangu nekaj kV/cm, kar je dosti veÄ kot pri elektrokemoterapiji. Pri ireverzibilni elektroporaciji lahko z
visoko natanÄnostjo odstranimo želeno tkivo ā obmoÄje med uniÄenim in nepoÅ”kodovanim tkivom je Å”iroko
le nekaj premerov celic (Rubinsky et al. 2007). Za odstranjevanje tumorjev tradicionalno uporabljamo
termiÄne metode (Hall et al. 2014) ā radiofrekvenÄno odstranjevanje in odstranjevanje s tekoÄim duÅ”ikom,
kjer tkivo uniÄujemo z visoko oz. z nizko temperaturo. Prednost ireverzibilne elektroporacije pred
uveljavljenimi termiÄnimi metodami je krajÅ”i Äas zdravljenja, izognemo se uÄinkom hlajenja oz. gretja tkiva
zaradi bližine žil (Golberg et al. 2015), pri Äemer ostanejo okoliÅ”ke pomembne strukture (žile, živci)
nedotaknjene (Jiang et al. 2015a). Tudi pri ireverzibilni elektroporaciji je v dokonÄno odstranitev tumorskih
celic vpleten imunski sistem (Neal et al. 2013).
Pri elektrokemoterapiji in ireverzibilni elektroporaciji se zaradi daljŔih pulzov in ponavljalne frekvence
1 Hz pojavljajo težave zaradi krÄenja miÅ”ic (MiklavÄiÄ et al. 2005), boleÄine med dovajanjem pulzov,
heterogenosti elektriÄnih lastnosti tkiv v tem frekvenÄnem podroÄju ter zaradi možnosti srÄnih aritmij (Ball
et al. 2010). BoleÄini in krÄenju miÅ”ic se lahko izognemo, Äe pulze dovajamo z viÅ”jo frekvenco, npr. 5 kHz
(ŽupaniÄ et al. 2007SerÅ”a et al. 2010). SrÄnim aritmijam se izognemo tako, da s sinhroniziramo dovedene
elektriÄne pulze z elektriÄno aktivnostjo srÄne miÅ”ice (Mali et al. 2008Deodhar et al. 2011aMali et al.
2015). BoleÄini, krÄenju miÅ”ic in heterogenosti elektriÄnih lastnosti tkiv se lahko izognemo z dovajanjem
1 Ī¼s bipolarnih pulzov (Arena et al. 2011Arena in Davalos 2012Sano et al. 2015). V zadnjem Äasu so se
pojavile tudi metode, s katerimi so vnos barvil v celico dosegli brezkontaktno s t. i. magnetoporacijo (Chen
et al. 2010Towhidi et al. 2012Kardos in Rabussay 2012Novickij et al. 2015Kranjc et al. 2016Novickij et al. 2017bNovickij et al. 2017a).
Elektroporacijo lahko uporabljamo ne le za zdravljenje tumorjev, temveÄ tudi za vnos uÄinkovin v kožo in
skoznjo. Vnos uÄinkovin skozi kožo je neinvaziven, poleg tega pa se izognemo degradaciji uÄinkovin pri
prehodu skozi prebavni trakt. Skozi kožo lahko preide le malo molekul, zato uporabljamo razliÄne metode
za poveÄanje prehoda uÄinkovin ā iontoforezo, radiofrekvenÄno mikroablacijo, laser, mikroigle, ultrazvok
in elektroporacijo (Zorec et al. 2013b). Proces elektroporacije kože je slabo razumljen. Predpostavljamo, da
pri dovajanju visokonapetostnih elektriÄnih pulzov v roženi plasti nastanejo lokalna transportna obmoÄja,
kjer sta poviÅ”ani elektriÄna prevodnost in prepustnost (Pliquett et al. 1996Pliquett et al. 1998Pliquett et
al. 1998PavÅ”elj in MiklavÄiÄ 2008a). Skozi lokalna transportna obmoÄja lahko nato uÄinkovine Å”e nekaj ur
po dovedenih pulzih vstopajo skozi kožo v krvni obtok (Zorec et al. 2013a). Gostota teh obmoÄij je odvisna
od elektriÄnega polja v koži ā viÅ”je elektriÄno polje jih povzroÄi veÄ. Velikost lokalnih transportnih obmoÄij
je odvisna od trajanja pulza. Med samim pulzom se zaradi Joulovega gretja topijo lipidi v roženi plasti, kar
povzroÄi njihovo Å”irjenje (Pliquett et al. 1996Prausnitz et al. 1996Pliquett et al. 1998Weaver et al. 1999Vanbever et al. 1999Gowrishankar et al. 1999b).
NaÄrtovanje posegov elektrokemoterapije in netermiÄnega odstranjevanja tkiva z ireverzibilno
elektroporacijo
Pri zdravljenju tumorjev z elektroporacijo lahko uporabimo standardne oblike in postavitve elektrod z že
doloÄenimi parametri elektriÄnih pulzov (Marty et al. 2006Mir et al. 2006Campana et al. 2014). Äe
zdravimo velike tumorje ali tumorje nepravilnih oblik, ki pogosto ležijo globlje, s standardno postavitvijo
elektrod ne moremo zagotoviti ustrezne pokritosti tumorja z dovolj visokim elektriÄnim poljem. V tem
primeru lahko elektrode med samim posegom veÄkrat premaknemo ali pa prilagodimo njihovo Å”tevilo in
postavitev. Pri tem moramo prej pripraviti naÄrt posega (Kos et al. 2010MiklavÄiÄ et al. 2010Pavliha et
al. 2012Linnert et al. 2012EdhemoviÄ et al. 2014). V njem zagotovimo, da bo cel tumor izpostavljen
dovolj visokemu elektriÄnemu polju (MiklavÄiÄ et al. 2006a), obenem pa Å”koda na okoliÅ”kem tkivu
minimalna.
NaÄrtovanje posega poteka v veÄ korakih: 1. zajem medicinskih slik (raÄunalniÅ”ka tomografija, magnetna
resonanca) tumorja in okoliÅ”kega tkiva2. obdelava slik3. razgradnja slik in doloÄitev geometrije tkiva4.
vzpostavitev tridimenzionalnega modela5. optimizacija postavitve elektrod glede na obliko in velikost
tumorja6. izdelava modela elektroporacije (izraÄun elektriÄnega polja in spremembe elektriÄne
prevodnosti tkiva)7. optimizacija napetosti med elektrodami in položaja elektrod (Pavliha et al. 2012). Na
sliki 1 lahko vidimo izraÄunano elektriÄno polje v tumorju in okoliÅ”kem tkivu pri eni izmed možnih
postavitev elektrod
Usposabljanja zaposlenih ter njihov vpliv na organizacijsko uÄenje in uspeÅ”nost v slovenskih storitvenih podjetjih
Rekonstrukcija preklopne avtomatike 5. bloka TEŠ: diplomsko delo visokoŔolskega strokovnega Ŕtudijskega programa
Mathematical modelling of cell membrane permeabilization and cell survival
V magistrski nalogi sem se ukvarjala z matematiÄnim modeliranjem permeabilizacije in preživetja celic. Pri elektrokemoterapiji in netermiÄni ablaciji tkiva z ireverzibilno elektroporacijo pred posegom pripravimo naÄrt posega, kjer predvidimo uniÄeno obmoÄje tkiva. Za mejo med živim in uniÄenim tkivom uporabljamo doloÄene vrednosti elektriÄnega polja. RealnejÅ”e naÄrte posega lahko dosežemo z uporabo matematiÄnih modelov, s katerimi napovemo od 0 % do 100 % uniÄenje. Na eksperimentalne podatke smo prilegali matematiÄne modele permeabilizacije in preživetja z metodo nelinearnih najmanjÅ”ih kvadratov. Za modeliranje permeabilizacije je najboljÅ”a Gompertzova krivulja. Pri modeliranju preživetja celic v odvisnosti od elektriÄnega polja sta najbolj primerna Peleg-Fermijev in logistiÄni model, v odvisnosti od Äasa pa logistiÄni model. Zdi se, da ima modeliranje deleža preživelih oz. permeabiliziranih celic potencial za uporabo v naÄrtovanju posegov.In this thesis I investigated mathematical modeling of cell membrane permeabilization and cell survival. When treating tumors with electrochemotherapy or non-thermal irreversible electroporaton as a method of tissue ablation we first prepare treatment plan. Currently we use a specific value of electric field to predict which cells will be destroyed and which will be not. We can predict the extent of tissue destruction more realistically using mathematical models of permeabilization and survival. Using these models the percentage of destroyed cells takes all the values between 0% and 100%. Using non-linear least squares method we fit mathematical models of permeabilization and survival. We evaluated goodness-of-fit using R^2. We identified Gompertz curve as the most suitable for modeling cell permeabilization. We found Peleg-Fermi and logistic mathematical model to be the most suitable for modeling cell survival. So far it seems possible to use mathematical models in treatment planning
Bacterial nanocellulose hydrogel for the production of 3D printed foils as an alternative to synthetic polymers in the field of packaging
Polimeri so postali pomemben sestavni del vsakdanjega življenja, vendar je vecina trenutno uporabljenih in proizvedenih polimerov izdelanih iz naftne osnove, kar predstavlja okoljski problem predvsem pri izdelkih, ki se hitro zavržejo. Zato se danes razvoj embalaže osredotoca na trajnostne materiale kot alternativo sinteticnim. Naravni materiali, kot je celuloza, so relativno poceni, netoksicni in trpežni, zato se uporabljajo v razlicnih aplikacijah, vkljucno z embalažo. Nanoceluloza, relativno nov naraven material, ima edinstvene lastnosti, kot so visoka trdnost, nizka teža in prosojnost, zaradi cesar je priljubljena v razlicnih aplikacijah, kot so embalaža, tekstil, papir, medicina, gradbeniŔtvo in elektronika. Tehnologije 3D tiskanja so postale pomemben del industrijskih in komercialnih procesov ter omogocajo inovativne ideje in funkcionalnosti, kot so 3D tisk funkcionalnih vitalnih organov in tkiv, protez, brezpilotnih letal, hrane in hiŔ.
Osnovni namen magistrskega dela je bil razvoj hidrogela bakterijske nanoceluloze s primernimi reoloŔkimi lastnostmi za 3D tisk polimernih folij. Tehnologije 3D tiskanja so postale pomemben del industrijskih in komercialnih procesov ter omogocajo realizacijo inovativnih idej in funkcionalnosti. Razvoj ekonomicnega 3D biotiskalnika je bil pomemben del raziskav in cilj magistrskega dela. Rezultati raziskav so pokazali, da so vsi izdelani hidrogeli iz bakterijske nanoceluloze in kationskega Ŕkroba primerni za 3D tisk, pri cemer je najboljŔi vzorec vseboval najvecjo koncentracijo kationskega Ŕkroba. 3D tiskane folije so bile homogene in mocne, vendar so bile folije z vecjo koncentracijo kationskega Ŕkroba nekoliko krhkejŔe. Vse folije so bile precej transparentne z nesijajno povrŔino in so ohranile slabŔo omocljivost z vodo. Razviti 3D tiskalnik predstavlja uporabno orodje za 3D tiskanje hidrogelov za razlicne aplikacije. Bakterijska nanoceluloza kot stranski produkt proizvodnje kisa predstavlja optimalno alternativo sinteticnim polimerom, saj je trajnostna ter prijazna tako okolju kot organizmom. S tega staliŔca je raziskava dokazala možnost uporabe bakterijske nanoceluloze kot vecinske komponente biofilamenta.Polymers have become an important part of everyday life today. Still, most currently used and produced polymers are made from petroleum, which poses an environmental problem, especially for quickly discarded products. Therefore, packaging development today focuses on sustainable materials as an alternative to synthetics. Natural materials such as cellulose are relatively inexpensive, non-toxic, and durable, making them suitable for various applications, including packaging. Nanocellulose, a relatively new natural material, has unique properties such as high strength, low weight, and transparency, making it popular in various applications such as packaging, textiles, paper, medicine, construction, and electronics. 3D printing technologies have become integral to industrial and commercial processes, enabling innovative ideas and functionalities such as 3D printing of functional vital organs and tissues, prosthetics, unmanned aircraft, food, and houses.
The main purpose of the master\u27s thesis was to develop a hydrogel of bacterial nanocellulose with suitable rheological properties for the 3D printing of polymer films. 3D printing technologies have become an important part of industrial and commercial processes, enabling the realization of innovative ideas and functionalities. Developing an economical 3D bioprinter was an important part of the research and the goal of the master\u27s thesis. The research results showed that all hydrogels made from bacterial nanocellulose and cationic starch were suitable for 3D printing, with the best sample containing the highest concentration of cationic starch. The 3D printed films were homogeneous and strong, although the films with a higher concentration of cationic starch were slightly more fragile. All films were quite transparent with a non-glossy surface and retained poor water wettability. The developed 3D printer represents a useful tool for 3D printing hydrogels for various applications. Bacterial nanocellulose, as a by-product of vinegar production, provides an optimal alternative to synthetic polymers as it is sustainable and environmentally friendly. From this perspective, the research has demonstrated the possibility of using bacterial nanocellulose as the main component of a biofilament
- ā¦