How to Recruit the Correct RNA Polymerase? Lessons from snRNA Genes.

Nuclear eukaryotic genomes are transcribed by three related RNA polymerases (Pol), which transcribe distinct gene sets. Specific Pol recruitment is achieved through selective core promoter recognition by basal transcription factors (TFs). Transcription by an inappropriate Pol appears to be rare and to generate mostly unstable products. A collection of short noncoding RNA genes [for example, small nuclear RNA (snRNA) or 7SK RNA genes], which play essential roles in processes such as maturation of RNA molecules or control of Pol II transcription elongation, possess highly similar core promoters, and yet are transcribed for some by Pol II and for others by Pol III as a result of small promoter differences. Here we discuss the mechanisms of selective Pol recruitment to such promoters

HCF-2 inhibits cell proliferation and activates differentiation-gene expression programs.

HCF-2 is a member of the host-cell-factor protein family, which arose in early vertebrate evolution as a result of gene duplication. Whereas its paralog, HCF-1, is known to act as a versatile chromatin-associated protein required for cell proliferation and differentiation, much less is known about HCF-2. Here, we show that HCF-2 is broadly present in human and mouse cells, and possesses activities distinct from HCF-1. Unlike HCF-1, which is excluded from nucleoli, HCF-2 is nucleolar-an activity conferred by one and a half C-terminal Fibronectin type 3 repeats and inhibited by the HCF-1 nuclear localization signal. Elevated HCF-2 synthesis in HEK-293 cells results in phenotypes reminiscent of HCF-1-depleted cells, including inhibition of cell proliferation and mitotic defects. Furthermore, increased HCF-2 levels in HEK-293 cells lead to inhibition of cell proliferation and metabolism gene-expression programs with parallel activation of differentiation and morphogenesis gene-expression programs. Thus, the HCF ancestor appears to have evolved into a small two-member protein family possessing contrasting nuclear versus nucleolar localization, and cell proliferation and differentiation functions

Interaction of ubiquitin ligase CBL with LMP2A protein of Epstein-Barr virus occurs via PTB domain of CBL and does not depend on adaptor ITSN1

Aim. Previously Latent membrane protein 2A (LMP2A) of Epstein-Barr virus was found to be ubiquitylated by CBL ubiquitin ligase but no direct interaction of LMP2A with CBL was reported. We aimed to explore this interaction and study a possibility of adaptor protein involvement. Taking into consideration that both LMP2A and CBL were shown to interact with endocytic adaptor protein intersectin 1 (ITSN1), we assumed that the latter could serve as a scaffold for LMP2A/CBL complex. Methods. We used an immunofluorescence and coimmuno- precipitation approaches to test a mutual complex formation of ITSN1, CBL and LMP2A proteins. Results. LMP2A coimmunoprecipitated with CBL while LMP2A did not interact with CBL G306E mutant harboring inactive phosphotyrosine-binding domain. We observed a triple colocalization of ITSN1, CBL and LMP2A signals in MCF-7 cells as well as coprecipitation of all mentioned proteins. Overexpression of ITSN1 did not affect the efficiency of complex formation of LMP2A with CBL. Moreover, LMP2A mutant unable to interact with ITSN1 was readily precipitated with CBL. Conclusions. LMP2A can be engaged in the complex together with endocytic adaptor ITSN1 and ubiquitin ligase CBL. We show that PTB domain of CBL is responsible for interaction with LMP2A. ITSN1 is not required for LMP2A recruiting to CBL.Відомо, що мембранний білок латентної фази 2А вірусу Епштейна-Барр убіквітинілюється убіквітин-лігазою CBL, хоча прямої взаємодії цих двох білків не виявлено. Наша мета полягала у дослідженні взаємодії LMP2A і CBL та вивченні можливості участі в цьому комплексі білкового адаптера. Беручи до уваги, що обидва зазначених білки взаємодіють з ендоцитозним адаптерним білком ITSN1, ми припустили, що останній може слугувати платформою для утворення комплексу LMP2A/CBL. Методи. Імунофлуоресцентний аналіз та коімунопреципітацію застосовано для дослідження можливості формування комплексу між ITSN1, CBL і LMP2A. Результати. Коімунопреципітація LMP2A і CBL свідчить про утворення комплексу цими білками, причому мутантна форма CBL, яка не здатна зв’язувати фосфотирозинові залишки, не взаємодіє з LMP2A. Ми спостерігали потрійну колокалізацію ITSN1, CBL і LMP2A у клітинах лінії MCF-7, а також коімунопреципітацію всіх зазначених білків. Надекспресія ITSN1 не впливає на ефективність коімунопреципітації LMP2A з CBL. Більш того, мутантний варіант LMP2A, не здатний зв’язуватися із ITSN1, ефективно взаємодіє з CBL. Висновки. LMP2A може входити до комплексу ендоцитозного адаптерного білка ITSN1 та убіквітин-лігази CBL. Участь ITSN1 не є необхідною для формування комплексу між LMP2A і CBL. Показано, що РТВ-домен убіквітин-лігази CBL відповідає за зв’язування з LMP2A.Известно, что мембранный белок латентной фазы 2А вируса Эпштейна-Барр убиквитинилируется убиквитин-лигазой CBL, однако прямого взаимодействия этих белков ранее обнаружено не было. Наша цель состояла в исследовании взаимодействия CBL и LMP2A, а также в изучении возможности участия в этом комплексе белкового адаптера. Принимая во внимание, что оба упомянутых белка взаимодействуют с эндоцитозным адаптерным белком ITSN1, мы предположили, что последний может служить платформой для образования комплекса LMP2A/CBL. Методы. Иммунофлуоресцентный анализ и коиммунопреципитацию использовали для изучения возможности образования комплекса с участием ITSN1, CBL и LMP2A. Результаты. Коиммунопреципитация CBL и LMP2A свидетельствует об образовании комплекса этими белками, причем мутантная форма CBL, лишенная способности связывать фосфотирозиновые остатки, не взаимодействует с LMP2A. Мы детектировали тройную колокализацию ITSN1, CBL и LMP2A в клетках линии MCF-7, а также ко-иммунопреципитацию вышеупомянутых белков. Суперэкспрессия ITSN1 не влияет на эффективность копреципитации CBL и LMP2A. Более того, мутантный вариант LMP2A, дефектный по связыванию с ITSN1, эффективно взаимодействовал с CBL. Выводы. LMP2A может включаться в комплекс эндоцитозного адаптера ITSN1 и убиквитин-лигазы CBL. Участие ITSN1 не является обязательным для образования комплекса LMP2A/CBL. Показано, что РТВ-домен убиквитин-лигазы CBL отвечает за связывание с LMP2A

Novel isoform of adaptor protein ITSN1 forms homodimers via its C-terminus

Aim. Previously we have identified a novel isoform of endocytic adaptor protein ITSN1 designated as ITSN1- 22a. Western blot revealed two immunoreactive bands of 120 and 250 kDa that corresponded to ITSN1-22a. The goal of this study was to investigate the possibility of dimer formation by the novel isoform. Methods. Dimerization ability of ITSN1-22a was tested by immunoprecipitation and subsequent Western blot analysis. To specify the region responsible for dimerization, site-directed mutagenesis and truncation analysis were carried out. Inhibition of endocytosis by potassium depletion and EGF stimulation of HEK293 were performed. Results. We have found that ITSN1-22a forms dimers in HEK293 cells. The dimerization of ITSN1-22a was mediated by C-terminal domain. We showed that cysteines C1016 and C1019 were involved in homodimerization. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis and mitogen stimulation did not affect ITSN1-22a dimer formation. Conclusions. ITSN1-22a is the only one known ITSN1 isoform, which is capable to form homodimers via disulphide bonds. This could be important for the formation of protein complexes containing ITSN1 molecules. Keywords: intersectin 1, isoform, homodimer.Мета. Раніше нами ідентифіковано нову ізоформу адаптерного білка ITSN1, названу ITSN1-22a. Вестерн-блот аналіз виявив наявність двох імунореактивних смуг 120 і 250 кДа, що відповідають ITSN1-22a. Мета цієї роботи полягала у вивченні здатності нової ізоформи формувати димери. Методи. Імунопреципітацію і Вестерн-блот аналіз використано для дослідження здатності ізоформи до димеризації. Ідентифікацію ділянки, що відповідає за формування димерів, здійснювали за допомогою сайтспрямованого мутагенезу та делеційного аналізу. Інгібування ендоцитозу індукували дефіцитом іонів калію. Для мітогенної стимуляції клітин HEK293 застосовано епідермальний фактор росту. Результати. Нами виявлено, що надекспресована в клітинах НЕК293 ізоформа ITSN1-22a формує димери. Димеризація обумовлена специфічним для цієї ізоформи С-кінцевим доменом. Нами показано, що цистеїни С1016 і С1019 залучені до процесу гомодимеризації. Інгібування клатрин-опосередкованого ендоцитозу та стимуляція клітин мітогеном не впливають на формування димерів ізоформою ITSN1-22a. Висновки. ITSN1-22a – це єдина відома на сьогодні ізоформа ITSN1, здатна утворювати гомодимери за допомогою дисульфідних зв’язків, що може бути важливим для формування ITSN1-вмісних білкових комплексів. Ключові слова: інтерсектин 1, ізоформа, гомодимер.Цель. Ранее мы идентифицировали новую изоформу адаптерного эндоцитозного белка ITSN1, названную ITSN1-22a. Вестерн-блот анализ выявил наличие двух иммунореактивных полос 120 и 250 кДа, соответствующих ITSN1-22a. Цель этой работы состояла в изучении возможности формирования димеров изоформой ITSN1-22a. Методы. Иммунопреципитация и Вестерн-блот анализ использованы для исследования возможности димеризации изоформы. Идентификацию участка, отвечающего за димеризацию, осуществляли с помощью сайт-направленного мутагенеза и делеционного анализа. Ингибирование эндоцитоза индуцировали дефицитом ионов калия. Для митогенной стимуляции клеток применен эпидермальный фактор роста. Результаты. Нами обнаружено, что сверхэкспрессированная в клетках НЕК293 изоформа ITSN1-22a формирует димеры. Димеризация изоформы обусловлена ее специфическим С-концевым доменом. Нами показано, что цистеины С1016 и С1019 вовлечены в процесс гомодимеризации. Ингибирование клатрин-опосредованного эндоцитоза и митогенная стимуляция клеток не влияют на формирование димеров изоформой ITSN1-22a. Выводы. ITSN1-22a – это единственная на сегодня изоформа ITSN1, способная образовывать гомодимеры посредством дисульфидных связей, что может быть важно для формирования ITSN1-содержащих белковых комплексов. Ключевые слова: интерсектин 1, изоформа, гомодимер

Amphiphysin 1 and 2 interact with latent membrane protein 2A of Epstein-Barr virus and regulate its exosomal secretion

Латентный мембранный белок 2А вируса Эпштейна-Барр является ключевым регулятором латентной фазы вирусной инфек- ции. Цель. Идентифицировать белки, способные связываться с пролин-обогащенными мотивами LMP2A. Методы. Анализ in silico при помощи программного обеспечения Scansite позволил предсказать взаимодействие амфифизина 1 (Amph1) и LMP2A. Использованы стандартные методы молекулярного клонирования, сайт-направленный мутагенез и тест на взаимодействие in vitro для последующего изучения структурных основ взаимодействия комплекса LMP2A/Amph1. Фракцию экзосом получали при помощи последовательных центрифугирований. Результаты. Показано, что изоформа LMP2A, но не LMP2АDNT взаимодействует с доменом SH3 Amph1. Выявленное взаимодействие опосредуется тремя разными пролин-обогащенными мотивами, расположенными в N-концевом участке LMP2A. Все три мотиваявляются взаимозаменяемыми, так как присутствия хотя бы одного из них оказывается достаточно для реализации связывания LMP2A с Amph1. Нами продемонстрировано связывание Amph1 и родственного ему Amph2 с LMP2A при помощи ко-иммунопреципитации эндогенных комплексов. Мутант LMP2A по пролиновым мотивам не взаимодействовал с Amph1, что привело к исчезновению его из фракции экзосом. Выводы. Латентный мембранный белок 2А вируса Эпштейна-Барр образует комплексы с эндоцитозными адаптерными белками Amph1 и Amph2. Идентифицированные новые партнеры LMP2A могут влиять на его внутриклеточный трафик и секрецию. Ключевые слова: вирус Эпштейна-Барр, LMP2A, амфифизин, экзосомы.Латентний мембранний білок 2А (LMP2A) вірусу Епштейна-Барр є важливим регулятором латентної фази вірусної інфекції. Мета. Ідентифікувати білки, які взаємодіють з пролін-збагаченими мотивами LMP2A. Методи. Аналіз in silico за допомогою програмного забезпечення Scansite дозволив передбачити можливість взаємодії амфіфізину 1 (Amph1) і LMP2A. Використано загально прийняті техніки молекулярного клонування, сайт-спрямований мутагенез і тест на взаємодію in vitro для подальшого дослідження структурних основ взаємодії комплексу LMP2A/Amph1. Фракцію екзосом отримано за допомогою послідовних центрифугувань. Результати. Показано, що ізоформа LMP2A, але не LMP2А DNT взаємодіє з доменом SH3 амфіфізину 1. Виявлена взаємодія опосередковується трьома різними пролін-збагаченими мотивами, розташованими в N-кінцевій ділянці LMP2A. Всі три мотиви є взаємозамінними, оскільки присутність хоча б одного з них є достатньою для реалізації зв’язування LMP2A з Amph1. Нами продемонстровано взаємодію Amph1 і високоспорідненого з ним Amph2 з LMP2A за допомогою ко-імунопреципітації ендогенних комплексів. Мутант LMP2A за проліновими мотивами не взаємодіяв з Amph1, що спричиняло зникнення його з фракції екзосом. Висновки. Латентний мембранний білок 2А вірусу Епштейна-Барр утворює комплекси з ендоцитозними адаптерними білками Amph1 і Amph2. Ідентифіковані нові партнери LMP2A можуть впливати на його внутрішньоклітинний трафік та секрецію. Ключові слова: вірус Эпштейна-Барра, LMP2A, амфіфізин, екзосоми.Latent membrane protein 2A (LMP2A) of Epstein-Barr virusisimplicated in the regulation of viral latency. The aim of the current study was to identify proteins interacting with proline-rich motifs of LMP2A. Methods. In silico prediction with Scansite allowed to recognize amphiphysin 1 (Amph1) as a binding partner of LMP2A. Molecular cloning techniques, site-directed mutagenesis, in vitro binding assay made it possible to study the interaction interface of Amph1/LMP2A complex. Sequential centrifugation steps were used to isolate an exosomal fraction. Results. LMP2A but not LMP2DNT mutant has been found to bind the SH3 domain of Amph1 via three distinct proline-rich motifs located in the N-terminal tail. All three motifs seem to be interchangeable as the presence of at least one of them was sufficient to mediate LMP2A/Amph1 interaction. Furthermore, the binding of LMP2A to Amph1 and related protein amphiphysin 2 was demonstrated by co-immunoprecipitation of endogenous complexes. We have found that inability of LMP2A mutant to bind Amph1 leads to the vanishing of the viral protein from the exosomal fraction. Conclusions. The latent membrane protein 2A of Epstein-Barr virus forms complexes with endocytic adaptor proteins Amph1 and Amph2. Described interaction might be involved in the regulation of intracellular traffic and secretion of LMP2A. Keywords: EBV, LMP2A, Amphiphysin, exosomes

Focal adhesion kinase (FAK1) regulates SHB phosphorylation and its binding with a range of signaling proteins

Aim. To investigate an effect of the Focal adhesion kinase 1 (FAK1) expression on the level of tyrosine phosphorylation of an adaptor protein SHB and to find functional consequences of this posttranslational modification. Methods. Recombinant DNA construction, protein expression and purification, human cell transfection, western blot. Results. The expression of FAK1 induces the massive tyrosine phosphorylation of SHB adaptor and enhances its interaction in vitro with SH2 domains of a range of the signaling proteins such as PI3K, ABL, CRK and PLCG1. Additionally we have found that Epstein-Barr virus protein LMP2A can partially mimic the FAK1-mediated effect strongly elevating the efficiency and SHB interaction with the mentioned above proteins. While the expression of individual proteins elevated SHB phosphorylation level, the co-expression of LMP2A and FAK1 did not display a synergetic effect. Conclusions. FAK1 as well as LMP2A induce the SHB tyrosine phosphorylation and enhance its interaction with a set of the signaling proteins.Мета. Дослідити ефект надексперсії кінази фокальної адгезії (FAK1) на рівнь фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та знайти функціональне значення цієї посттрансляційної модифікації. Методи. Конструювання рекомбінантних ДНК, експресія та очистка рекомбінантних білків, трасфекція клітинних ліній, вестерн блот. Результати. Надексперсія FAK1 в клітинах лінії 293 викликає масивне фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та значно підсилює його взаємодію in vitro з SH2-доменами низки сигнальних білків, таких як PI3K, ABL, CRK та PLCg1. Крім того, білок LMP2A вірусу Епштейна-Барр може посилювати in vitro зв’язування SHB з вищезазначеними білками, так само, як і FAK1. Тоді як надекспресія окремих білків FAK1 та LMP2A підвищувала рівні фосфорилювання SHB, їх ко-експерсія не мала синергічного ефекту. Висновки. Експресія FAK1 та LMP2A індукує фосфорилювання залишків тирозину адапторного білка SHB та підсилює його взаємодію з SH2-доменами низки сигнальних білків.Цель. Исследовать эффект суперэкспрессии киназы фокальной адгезии (FAK1) на уровень фосфорилирования остатков тирозина адаптерного белка SHB и найти функциональное значение этой посттрансляционной модификации. Методы. Конструирование рекомбинантных ДНК, экспрессия и очистка рекомбинантных белков, трансфекция клеточных линий, вестерн блот. Результаты. Суперэксперссия FAK1 в клетках линии 293 приводит к многократному повышению уровней фосфорилирования остатков тирозина адаптерного белка SHB, что в свою очередь приводит к усилению взаимодейсвия с SH2-доменами ряда сигнальных белков, таких как PI3K, ABL, CRK та PLCg1. Кроме того, белок LMP2A вируса Эпштейна-Барр может усиливать in vitro взаимодействие SHB с указанными белками, аналогично FAK1. Тогда как суперэкспрессия отдельных белков FAK1 та LMP2A приводила к интенсификации фосфорилирования SHB, их ко-экспрессия не обладала синергическим эффектом. Выводы. Экспрессия FAK1 и LMP2A индуцирует фософрилирование остатков тирозина адаптерного белка SHB и усиливает его взаимодействие с SH2-доменами ряда сигнальных белков

ITSN protein family: regulation of diversity, role in signalling and pathology

Adaptor/scaffold proteins of the intersectin (ITSN) family are important components of endocytic and signalling complexes. They coordinate trafficking events with actin cytoskeleton rearrangements and modulate the activity of a variety of signalling pathways. In this review, we present our results as a part of recent findings on the function of ITSNs, the role of alternative splicing in the generation of ITSN1 diversity and the potential relevance of ITSNs for neurodegenerative diseases, cancer.Адапторні білки родини інтерсектинів (ITSN) є важливими компонентами ендоцитозних і сигнальних комплексів. Вони координують внутрішньоклітинний трафік і перебудови актинового цитоскелета та модулюють активність різних сигнальних шляхів. В огляді представлено результати наших досліджень, а також дані інших лабораторій стосовно функції ITSN, ролі альтернативного сплайсингу у формуванні різноманіття ізоформ ITSN1 і зв’язку інтерсектинів з нейродегенеративними хворобами, злоякісними пухлинами.Адапторные белки семейства интерсектинов (ITSN) – важные компоненты эндоцитозных и сигнальных комплексов. Они координируют внутриклеточный трафик и перестройки актинового цитоскелета, а также модулируют активность различных сигнальных путей. В обзоре представлены результаты наших исследований и данные других лабораторий относительно функции ITSN, роли альтернативного сплайсинга в формировании разнообразия изоформ ITSN1 и связи интерсектинов с нейродегенеративными заболеваниями, злокачественными опухолями

Alternative splicing affecting the sh3a domain controls the binding properties of intersectin 1 in neurons

a b s t r a c t Intersectin 1 (ITSN1) is a conserved adaptor protein implicated in endocytosis, regulation of actin cytoskeleton rearrangements and mitogenic signaling. Its expression is characterized by multiple alternative splicing. Here we show neuron-specific expression of ITSN1 isoforms containing exon 20, which encodes five amino acid residues in the first SH3 domain (SH3A). In vitro binding experiments demonstrated that inclusion of exon 20 changes the binding properties of the SH3A domain. Endocytic proteins dynamin 1 and synaptojanin 1 as well as GTPase-activating protein CdGAP bound the neuron-specific variant of the SH3A domain with higher affinity than ubiquitously expressed SH3A. In contrast, SOS1, a guanine nucleotide exchange factor for Ras, and the ubiquitin ligase Cbl mainly interact with the ubiquitously expressed isoform. These results demonstrate that alternative splicing leads to the formation of two pools of ITSN1 with potentially different properties in neurons, affecting ITSN1 function as adaptor protein. Ó 2008 Elsevier Inc. All rights reserved. Intersectin 1 (ITSN1) is an evolutionarily conserved adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, apoptosis, signal transduction, and regulation of cytoskeletal rearrangements ITSN1 has been shown to interact with several essential endocytic proteins, including dynamin, epsin, Eps15, and synaptojanin Previously, we found seven additional splice variants of the human and mouse ITSN1 genes In view of the potential link between alternative exon 20 usage and the binding properties of ITSN1, we have investigated the interaction of two SH3A domain splice variants with the main ITSN1 protein partners. The results presented here highlight differences in the binding properties of alternatively spliced SH3A domains of ITSN1 and showed how alternative splicing can regulate the functions of ITSN1 as adaptor protein. Materials and methods Expression constructs. The cDNA sequences corresponding to the proline-rich region (PRD) of dynamin 1 (residues 742-851, GenBank Accession No. NP_0010053360), SOS1-IsfI (residues 0006-291X/$ -see front matter

Differential recognition of ITSN2/Ese2 by the SH2 domains of Fyn, Abl1, PLCg1 and PI3KR1 in mouse tissues

Phosphorylation of endocytic adaptor ITSN2 that enabled its interaction with the SH2 domains of signaling proteins was recently reported. The aim of this study was to determine whether tissue-specific ITSN2 phosphorylation and subsequent recognition by phosphotyrosine-binding domains could occur in mouse tissues. Methods. In silico prediction of interaction motifs, expression of recombinant proteins in bacterial system, GST pull-down analysis, immunoblotting. Results. Analysis of phosphoproteomic data demonstrated tyrosine phosphorylation of mouse ITSN2 homologue, Ese2 protein. Scansite service was used to predict binding motifs for the SH2 domains of Fyn, Abl1, PLCg1 and PI3KR1 within Ese2. Comparison of ITSN2 and Ese2 sequences showed conservation of predicted interaction motifs between human and mouse. GST-fused SH2 domains of Fyn, Abl1, PLCg1 and PI3KR1 were obtained and used as phosphorylation «sensors» of tyrosine-based motifs within Ese2 molecule. Binding of Ese2 to the SH2 domains of Fyn and PLCg1 was observed in brain, lung and heart whereas SH2 domains of Abl1 and PI3KR1 interacted with Ese2 in lung and heart only. Conclusions. Differential Ese2/ SH2 interactions in tissues suggest that tissue-specific tyrosine phosphorylation might regulate specific binding of the Ese2 adaptor to the signaling molecules.Нещодавно виявлено фосфорилювання адаптора ендоцитозу ITSN2, що забезпечує впізнавання цього білка SH2-доменами білків, залучених до передачі мітогенного сигналу. Метою цієї роботи було перевірити, чи має взаємодія ITSN2 з SH2-вмісними біл- ками тканиноспецифічний характер. Методи. Передбачення мотивів взаємодії in silico, експресія білків у бактерійній системі та культурі клітин ссавців, преципітація з використанням білків, злитих з GST. Результати. Дані фосфопротеомних досліджень свідчать про фосфорилювання тирозинових залишків гомолога ITSN2 миші, білка Ese2. За допомогою сервісу Scansite у складі Ese2 передбачено мотиви взаємодії з доменами SH2 білків Fyn, Abl1, PLCg1 і PI3KR1. Порівняння послідовностей інтерсектинів людини та миші показало консервативність передбачених мотивів. Отримано злиті з GST домени SH2 білків Fyn, Abl1, PLCg1 і PI3KR1, які використано для преципітації білка Ese2 з лізатів мозку, легень і серця миші. Зв’язування Ese2 з доменами SH2 білків Fyn і PLCg1 спостерігали в усіх досліджуваних тканинах, тоді як домени SH2 білків Abl1 і PI3KR1 упізнавали Ese2 лише в легенях та серці. Висновки. Диференційне впізнавання Ese2/SH2 у тканинах дозволяє припустити, що тканиноспецифічне фосфорилювання регулює специфічне зв’язування адапторного білка Ese2 із сигнальними молекулами.Недавно показано фосфорилирование адаптора эндоцитоза ITSN2, опосредующее узнавание этого белка SH2-доменами белков, вовлеченных в передачу митогенного сигнала. Целью этой работы было проверить, имеет ли взаимодействие ITSN2 с SH2- содержащими белками тканеспецифический характер. Методы. Предсказание мотивов взаимодействия in silico, экспрессия белков в бактериальной системе и культуре клеток млекопитающих, преципитация с использованием белков, слитых с GST. Результаты. Данные фосфопротеомных исследований свидетельствуют о фосфорилировании тирозиновых остатков гомолога ITSN2 мыши, белка Ese2. При помощи сервиса Scansite в составе Ese2 предсказано мотивы взаимодействия с доменами SH2 белков Fyn, Abl1, PLCg1 и PI3KR1. Сравнение последовательностей интерсектинов человека и мыши показало консервативность предсказанных мотивов. Получены слитые с GST домены SH2 белков Fyn, Abl1, PLCg1 и PI3KR1, использованных для преципитации белка Ese2 из лизатов головного мозга, легких и сердца мыши. Связывание Ese2 с доменами SH2 белков Fyn и PLCg1 наблюдали во всех исследованных тканях, тогда как домены SH2 белков Abl1 и PI3KR1 узнавали Ese2 только в тканях легких и сердца. Выводы. Дифференциальное узнавание Ese2/SH2 в тканях позволяет предположить, что тканеспецифическое фосфорилирование опосредует специфическое связывание адаптерного белка Ese2 с сиг- нальными молекулами

Mechanism of selective recruitment of RNA polymerases II and III to snRNA gene promoters

RNA polymerase II (Pol II) small nuclear RNA (snRNA) promoters and type 3 Pol III promoters have highly similar structures; both contain an interchangeable enhancer and "proximal sequence element" (PSE), which recruits the SNAP complex (SNAPc). The main distinguishing feature is the presence, in the type 3 promoters only, of a TATA box, which determines Pol III specificity. To understand the mechanism by which the absence or presence of a TATA box results in specific Pol recruitment, we examined how SNAPc and general transcription factors required for Pol II or Pol III transcription of SNAPc-dependent genes (i.e., TATA-box-binding protein [TBP], TFIIB, and TFIIA for Pol II transcription and TBP and BRF2 for Pol III transcription) assemble to ensure specific Pol recruitment. TFIIB and BRF2 could each, in a mutually exclusive fashion, be recruited to SNAPc. In contrast, TBP-TFIIB and TBP-BRF2 complexes were not recruited unless a TATA box was present, which allowed selective and efficient recruitment of the TBP-BRF2 complex. Thus, TBP both prevented BRF2 recruitment to Pol II promoters and enhanced BRF2 recruitment to Pol III promoters. On Pol II promoters, TBP recruitment was separate from TFIIB recruitment and enhanced by TFIIA. Our results provide a model for specific Pol recruitment at SNAPc-dependent promoters