Produção de celulose bacteriana: identificação do Operon bcs e produção de biofilme celulósico por Chromobacterium violaceum

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química.Exopolissacarídeos (EPS) são os principais constituintes de biofilme bacteriano. Esses polímeros, componentes da matriz extracelular bacteriana, têm despertado grande interesse em aplicações industriais e na área médica. Entretanto, têm sido associado com mecanismos de combate bacteriano. A celulose tem sido identificada como um dos EPS da matriz extracelular produzido por várias espécies de bactérias durante a formação de biofilmes. A bactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum, linhagem ATCC 12472, teve seu genoma recentemente seqüenciado pelo Brazilian National Genome Project Consortion. A análise do genoma da C. violaceum mostrou a presença de genes relacionados à biossíntese de celulose, até então desconhecidos. Neste trabalho, analisou-se a estrutura e organização dos genes diretamente envolvidos na biossíntese de celulose, e buscou-se evidências experimentais da presença de celulose na matriz extracelular do biofilme formado por esta bactéria. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do seu genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Ensaios laboratoriais foram utilizados para se obter evidências experimentais das informações genômicas. Estas estratégias permitiram determinar a existência de um operon que compreende cinco genes estruturais codificando as proteínas e enzimas do complexo celulose sintase, como também propor uma via metabólica de biossíntese de celulose a partir de glicose. Identificaram-se ainda 43 ORFs (open reading frames) com domínio GGDEF normalmente associado à atividade de síntese de diguanilmonofosfato cíclico (c-di-GMP) a partir de duas moléculas de guanosina trifosfato (GTP). A molécula c-di-GMP funciona como um componente regulatório de diversas atividades celulares, entre elas a ativação da síntese de celulose. Experimentalmente foi analisado o produto do biofilme formado durante o cultivo de C. violaceum em meio Luria Bertani (LB), culturas estática e agitada. Os resultados obtidos sugerem a presença de celulose como componente do biofilme

Desenvolvimento de novos biomateriais baseados em celulose bacteriana para aplicações biomédicas e de engenharia de tecidos

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2008.Membranas porosas constituídas de nanofibras de celulose bacteriana foram produzidas pela bactéria Gluconacetobacter hansenii ATCC 23769, quando cultivada em um meio de cultura apropriado e sob circunstâncias estáticas. A formação in situ dos poros foi desenvolvida com o uso de moldes adequados. As propriedades físico-químicas da membrana de celulose bacteriana, tais como o grau de cristalinidade e a deformação à tração não foram alteradas significativamente após a formação dos poros. Sugere-se que as membranas assim constituídas de microporos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, que exigem elevadas taxas de oxigenação ou que exigem atraso da contração tecidual. Estruturas tridimensionais em forma de hidrogel de celulose bacteriana foram produzidas utilizando a bactéria G. hansenii em culturas sob condições agitadas e meio de cultivo apropriado. Estas estruturas, com geometria esferóide, elipsóide ou ovóide, são compostas por uma massa gelatinosa, em forma de "cocoon", envolvida por uma membrana densa. Hidrogéis macroscópicos tridimensionais vascularizados de celulose bacteriana foram desenvolvidos através das condições previamente descritas, utilizando-se moldes para a formação de vasos. A massa gelatinosa está envolvida por uma membrana elástica. No seu interior foram produzidos canais que podem simular vasos sanguíneos. Um compósito constituído de celulose bacteriana e acemanana foi preparado através do cultivo da bactéria G. hansenii em meio de cultivo suplementado com acemanana, um polissacarídeo proveniente da planta Aloe barbadensis Miller. Esse compósito também apresenta uma estrutura tridimensional gelatinosa, composta por nanofibras de celulose e acemanana dispersas leatoriamente, envolvido por uma densa membrana externa. O grande diferencial deste biomaterial é a incorporação da acemanana nas nanofibras de celulose, com possíveis benefícios terapêuticos da acemanana. A estrutura química da celulose favorece a síntese de hidroxiapatita na sua superfície, transformando-a num biomaterial com propriedades possíveis de promover a recuperação de tecidos ósseos e cartilaginosos. Uma estrutura hidrogel tridimensional multicamada composta de celulose bacteriana e hidroxiapatita foi produzida através de mineralização de hidroxiapatita na superfície das nanofibras de celulose. Foi observado que a hidroxiapatita foi depositada na superfície e está homogeneamente distribuída nas nanofibras de celulose. Os estudos reportados neste trabalho ampliam o potencial de aplicação da celulose bacteriana, sobretudo de biomateriais derivados da plataforma tridimensional obtida em culturas hidrodinamicamente controladas.Porous, nanofibrous bacterial cellulose membranes were produced by the bacterium Gluconacetobacter hansenii ATCC 23769. The bacterium was cultivated in an appropriate culture medium under static conditions. In situ pore formation was attained through the use of adequate pin templates. Physico-chemical properties of BC membranes, like degree of crystallinity, swelling and tensile strength were not significantly altered after pore formation. Microporous membranes could be useful for applications in repairing tissues, which require high oxygenation rates or wound contracture delay. Three-dimensional bacterial cellulose hydrogels were produced using the bacterium G. hansenii in agitated appropriate culture. The structures exhibit a rough ellipsoid geometry and are composed by a gelatinous mass involved by a denser membrane, which resembles a "cocoon". Macroscopic vascular three-dimensional bacterial cellulose hydrogels were produced by the same conditions previously described, using appropriate templates for vessels formation. The vessels, that simulate blood vessels, were formed in the inner part of the hydrogel. Three-dimensional bacterial cellulose hydrogels acemannan composite material was produced by supplementing the culture medium with acemannan, which is a polysaccharide extracted from Aloe barbadensis Miller. The composite exhibits a three-dimensional hydrogel structure composed of cellulose and acemannan fibers bonded together, random dispersed in the gel and enclosed by a dense external membrane. This new biomaterial is a potential candidate for medical applications due to the therapeutic properties of acemannan. The chemical structure of the cellulose nanofibers favors the nucleation of hydroxyapatite on their surface, which indicates the potential of cellulosehydroxyapatite composites for applications in tissue engineering for cartilaginous and bone tissue regeneration. A three-dimensional multilayer structure comprised of bacterial cellulose and hydroxyapatite was produced through mineralization of hydroxyapatite on the surface of the cellulose nanofibers. The hydroxyapatite particles were deposited and homogeneously distributed over the surface of the fibers. The studies reported in this work extend the potential of bacterial cellulose, especially of biomaterials derived from the three-dimensional bacterial cellulose based platform obtained with hydrodynamically controlled cultures

PRODUÇÃO DE CELULOSE BACTERIANA A PARTIR DE DIFERENTES SUBSTRATOS

A celulose bacteriana em biopolímero com características especiais que o torna aplicável na manufatura de artefatos de aplicação médica, bem como suporte estrutural para a engenharia de tecidos. O presente trabalho objetivou avaliar a produção de celulose bacteriana por Gluconoacetobacter hansenii a partir de três substratos carbônicos, glicose glicerol e manitol. Para isto a bactéria foi cultivada em meios contendo cada um dos substratos separadamente, na concentração de 25 g/l. A produção de celulose foi avaliada a partir da pesagem do biopolímero que cresceu na superfície do caldo de cultivo, foi acompanhada durante 14 dias. Os resultados mostraram que houve produção de celulose a partir dos três substratos estudados, sendo esta que na presença de glicerol ocorreu a maior conversão de substrato em produto, com um rendimento de 36 g de celulose/ 100g de substrato. Os resultados são promissores tendo em vista que atualmente o glicerol é um substrato de baixo custo o que contribui para o decréscimo do custo de produção final deste biopolímero com diversas aplicações biomédicas

Obtaining and characterization of bacterial cellulose synthesized by Komagataeibacter hansenii from alternative sources of nitrogen and carbon

This work aimed to obtain and characterize bacterial cellulose (BC) membranes obtained by cultivating Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 using mannitol, glucose, fructose, lactose, glycerol, inulin, and sucrose as carbon sources, and corn steep liquor and Prodex Lac® as alternative sources of nitrogen. The formation of the BC´s gelatinous membrane was monitored for 12 days under static conditions and a temperature of 30 ºC. After purification, the membranes were dried and characterized by thermogravimetric analysis (TGA), Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR), and scanning electron microscopy (SEM). The highest BC concentrations were found in the culture medium containing Prodex Lac® as the source of nitrogen. Among sugars, fructose and mannitol presented the best results. TGA analyzes indicate that all membranes have similar thermal behavior. The FTIR results show that the chemically synthesized membranes are equivalent to the structures cited in the literature. The micrographs obtained by SEM showed that the medium might influence BC´s morphology, but in general, all presented nanofibers, an essential feature in the membrane. Thus, the BC membranes synthesized in this study proved that the BC production using low-cost alternative means is feasible. The material obtained meets the expected thermal, physical, and chemical properties.Keywords: Bacterial cellulose, corn steep liquor, Prodex Lac®, nitrogen sources, carbon sources

Bacterioplankton Activity in a Meso-eutrophic Subtropical Coastal Lagoon

The aim of this study was to investigate whether the bacterioplankton activity in the meso-eutrophic Conceição Lagoon would increase significantly under allochthonous inputs of inorganic nutrients and organic carbon. Abundance and biomass of bacterioplankton were evaluated under three treatments: light (14 h light/10 h dark), complete darkness (dark-control), and nutrient (C + N + P—dark, 100 : 10 : 1) enrichments during 72 h. Nutrient enrichments promoted a significant increase in abundance (maximum of 19.0 ×109 cells·L−1 in the first 32 hours) and biomass of the heterotrophic bacterioplankton, which induced the formation of large clusters. Bacterial biomass remained constant in the non-enriched incubations (dark-control and light). Bacterial growth rates were significantly higher after nutrient additions (1.35 d−1), followed by control (0.79 d−1), and light (0.63 d−1) treatments, which were statistically equal (p>0.05). Bacterial production rates were also significantly higher under nutrient additions (1.28 d−1), compared to the control and light (0.50 d−1 and 0.44 d−1, respectively), demonstrating that bacterial growth and production in this meso-eutrophic lagoon are under an immediate “bottom-up” regulation, followed by a potential top-down effect. These facts reinforce the urgency on improving the local wastewater management plan in order to prevent further expansion of anoxic waters