The role of membrane glycoproteins in ovarian cancer

In advanced ovarian cancer disease responses to chemotherapy are very low and are characterized with early relapse. Metastasis in the peritoneal cavity is one of the main caveats and there is no effective treatment to reduce metastasis and consequently limit disease evolution.In this study we report the effect of blocking CA125-mesothelin mediated cell adhesion in a mouse model system permitting in vivo imaging of peritoneal metastasis. We developed a luciferase-based system to monitor peritoneal metastasis progression. One day after IP implantation of luciferase-transfected human ovarian cancer cells (OVCAR5), mice were injected intraperitoneally (IP) with 5 mg/Kgr of anti-CA125 mAb (X52) and/or anti-mesothelin mAb (K1) or anti-mesothelin Bb (P4). Our preclinical study demonstrated that IP injections of acombination of X52 and K1 resulted in reduced tumor micrometastasis as assessed by in vivo imaging. Further analysis of the tumor microenvironment revealed a diminished presence of myeloid-derived suppressor cells (MDSCs).Tumoral mucins, which are heavily glycosylated tumor antigens such as mesothelin are attached to tumor cells by mannose residue-containing glycolipids (GPI anchors). However, the binding of soluble mesothelin via mannose residues to mannose receptor has not been systematically studied. To address this issue, we analyzed the binding of tumor-released mesothelin to ascites-infiltrating macrophages from ovarian cancer patients. We also modeled functional interactions between macrophages and soluble mesothelin using an in vitro system of co-culture of healthy donor macrophages with human ovarian cancer cell lines in transwells. We found that soluble mesothelin binds to human macrophages and that the binding depended on the presence of GPI anchor and mannose receptor. We next challenged the system with antibodies directed against the mannose receptor domain 4 (CDR4-MR). We isolated three novel anti-CDR4-MR human recombinant antibodies (scFv) using a yeast-display library of human scFv. Anti-CDR4-MR scFv #G11 could block mesothelin binding to macrophages and prevent tumor-induced phenotype polarization of CD206low macrophages towards TAMs. Our findings indicate that tumor-released mesothelin is linked to GPI anchor, engages macrophage mannose receptor, and contributes to macrophage polarization towards TAMs. We propose that compounds capable of blocking tumor antigen GPI anchor/CD206 interactions, such as our novel anti-CRD4-MR scFv, could prevent tumor-induced TAM polarization and have therapeutic potential against ovarian cancer, through controlling the polarization of tumor-infiltrating innate immune cells.Studying the tumor microenvironment is critical for designing appropriate therapeutic strategies against ovarian cancer. The cell surface protein B7-H4 (B7x/B7s) is expressed by various cancers and B7-H4+ tumor-associated macrophages (TAMs) or surrogate APCs negatively regulate T cell activation, possibly through interaction with a putative receptor, suggesting that targeting of surface B7-H4 with affinity reagents could mediate clinical effects. We studied B7-H4 cell surface expression in human samples from ovarian cancer ascites and solid tumors, as well as in human ovarian cancer cell lines after mouse passage and/or short term culture. B7-H4 was expressed on tumor-infiltrating macrophages and freshly harvested tumor cells derived from cancer patients and from a mouse xenograft model. However, B7-H4 cell surface expression was downregulated on tumor cells after short term in vitro culture. We next isolated anti-B7-H4 recombinant antibodies (scFvs) by differential screenings of a yeast-display scFv library derived from ovarian cancer patient's human B lymphocytes. Anti-B7-H4 scFvs reversed T-cell inhibition mediated by a B7-H4 recombinant protein, in response to anti-CD3 stimulation. Furthermore, anti-B7-H4 scFv 3#68 restored antigen-specific T cell suppression, mediated by B7-H4+ antigen-loaded APCs or B7-H4+ tumor cells (presentation in cis), and by TAMs (presentation in trans). Our data demonstrate that B7-H4 cell surface expression is inducible in vivo which enables cell surface targeting strategies against B7-H4, and further show that antibody blockade of B7-H4 can restore anti-tumor T cell responses in vitro.Ιn summary, we have elucidated the role of the abundant tumor released glycoproteins such as mesothelin and CA125 in the promotion of ovarian micrometastasis. Furthermore, we studied the consequences of mesothelin binding to its newly identified ligand, the macrophage mannose receptor. We found that blockade of such interactions could protect macrophages from tumor polarizationand preserve their pro-inflammatory phenotype. Moreover, we characterized the expression of B7-H4 in the ovarian cancer microenvironment and the B7-H4-mediated inhibition of tumor antigen-specific T cells. Finally, we identified novel anti-MR and anti-B7-H4 recombinant antibodies and evaluated their application for the development of new immunotherapeutic methods against ovarian cancer.Καθώς η θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με τις συμβατικές χημειοθεραπείες δεν είναι αποτελεσματική, αναζητούνται προσεγγίσεις που στοχεύουν συγκεκριμένους καρκινικούς στόχους ή ειδικά σηματοδοτικά μονοπάτια.Ένας από τους στόχους αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου των γλυκοπρωτεϊνών μεσοθηλίνη και CA125 στην εξέλιξη και μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών αλλά και η διερεύνηση εφαρμογών, που βασίζονται σε αντισώματα, με σκοπό τον περιορισμό των περιτοναϊκών μεταστάσεων. Έτσι, υποθέσαμε ότι η ταυτόχρονη στόχευση των δύο αυτών γλυκοπρωτεϊνών θα μπορούσε να περιορίσει πιο αποτελεσματικά τη μετάσταση. Για να ελέγξουμε την παραπάνω υπόθεση αναπτύξαμε ένα μοντέλο μεταστατικού καρκίνου των ωοθηκών στον ποντικό. Σύμφωνα με την in vivo απεικόνιση, η τοπική χορήγηση του συνδυασμού των δύο αντισωμάτων που στοχεύουν την μεσοθηλίνη και το CA125 περιόρισε τις μικρομεταστάσεις σε σύγκριση με τις ομάδες ποντικών στα οποία χορηγήθηκαν μεμονωμένα αντισώματα. Η ανάλυση των ανοσοποιητικών κυττάρων του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος της περιτοναϊκής κοιλότητας έδειξε πως η συνδυασμένη θεραπεία περιόρισε α) τις μικρομεταστάσεις, β) το καρκινικό φορτίο και γ) τα δραστικά προερχόμενα από το μυελό ανοσοκατασταλτικά κύτταρα (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs). Η σημασία της παρατήρησής μας είναι προφανής, αφού ένα καρκινικό μικροπεριβάλλον με λιγότερα ανοσοκατασταλτικά στοιχεία ευνοεί την ανοσολογική απόρριψη του όγκου.Η μεσοθηλίνη, εκτός από μια γλυκοπρωτεΐνη προσδεδεμένη στην κυτταρική επιφάνεια μέσω «άγκυρας» γλυκοσυλο-φωσφατιδυλο-ϊνοσιτόλης (GPI), υπάρχει και σε εκκρινόμενη μορφή και συνιστά έναν καρκινικό δείκτη στον ορό των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Διατυπώσαμε την υπόθεση ότι τα καρκινικά αντιγόνα με άγκυρα GPI όπως η μεσοθηλίνη, μπορούν να δεσμεύονται στον υποδοχέα της μαννόζης (MR) που εκφράζεται από τα μακροφάγα τα οποία διηθούν τους καρκίνους, μέσω των τελικών καταλοίπων μαννόζης. Επίσης η πρόσδεση της εκκρινόμενης από καρκινικά κύτταρα μεσοθηλίνης στον MR, θα μπορούσε να συνεισφέρει στην ενεργοποίηση των μακροφάγων προς έναν εναλλακτικό, σχετιζόμενο με τον καρκίνο φαινότυπο (TAM). Για να διερευνήσουμε την παραπάνω υπόθεση ελέγξαμε την ύπαρξη προσδεδεμένης μεσοθηλίνης στην επιφάνεια μακροφάγων από ασκίτες ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Με κυτταρομετρία ροής βρήκαμε ότι τα μακροφάγα τα οποία εξέφραζαν τον υποδοχέα της μαννόζης είχαν στην επιφάνειά τους προσδεδεμένη μεσοθηλίνη. Σε in vitro πειράματα που περιελάμβαναν καλλιέργεια ώριμων μακροφάγων και καρκινικών σειρών ωοθήκης σε συστήματα transwell, επιβεβαιώσαμε την πρόσδεση της εκκρινόμενης από καρκινικά κύτταρα μεσοθηλίνης σε μακροφάγα που στο τεχνητό καρκινικό περιβάλλον υπερεκφράζουν τον υποδοχέα της μαννόζης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε πως η εκκρινόμενη μεσοθηλίνη που δεν διαθέτει άγκυρα GPI δεν προσδένεται σε μακροφάγα. Για να αποδείξουμε πως η πρόσδεση οφειλόταν στον υποδοχέα της μαννόζης απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα κατά της υπομονάδας που αναγνωρίζει με ειδικότητα κατάλοιπα μαννόζης (anti-CDR4-MR human recombinant antibodies (scFv) μετά από σάρρωση βιβλιοθήκης ζύμης που εκφράζει στην επιφάνειά της ανασυνδυασμένα αντισώματα. Τα αντισώματα αυτά παρεμπόδισαν την πρόσδεση της μεσοθηλίνης. Επιπλέον, ο κλώνος #G11, απέτρεψε την πόλωση των μακροφάγων σε φαινότυπο TAM. Αυτό αποδεικνύει πως παράγοντες ικανοί να ρυθμίζουν την πόλωση των μακροφάγων στο καρκινικό μικροπεριβάλλον είναι δυνατόν να πυροδοτήσουν την απόρριψη του όγκου από τοανοσοποιητικό σύστημα.Για να διευρύνουμε τη στόχευση των σχετιζόμενων με τον καρκίνο μακροφάγων (ΤΑΜ), μελετήσαμε επίσης την γλυκοπρωτείνη Β7-Η4 που 1) αντιπροσωπεύει έναν από τους σημαντικούς καταστολείς των Τ λεμφοκυττάρων, 2) υπερεκφράζεταιι στα ΤΑΜ και 3) συσχετίζεται με αυξημένη επιθετικότητα και κακή πρόγνωση για την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Μετά από ανάλυση πρωτογενών καρκινικών κυττάρων από ασκίτες ή συμπαγείς όγκους ή από ποντικούς στους οποίους είχαν δημιουργηθεί όγκοι ωοθήκης, εντοπίσαμε αυξημένη έκφραση του Β7-Η4 στην κυτταρική επιφάνεια. Επίσης, βρήκαμε πως τα διηθούμενα στον όγκο μακροφάγα παρουσίαζαν αυξημένη επιφανειακή έκφραση του Β7-Η4. Για τη στόχευση του Β7-Η4 των καρκινικών κυττάρων και των ανοσοκατασταλτικών ΤΑΜ, απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα. Επιλεγμένοι κλώνοι αντισωμάτων κατά του Β7-Η4 μελετήθηκαν λεπτομερώς για την ικανότητά τους να παρεμποδίζουν την ανοσοκατασταλτική δράση του Β7-Η4. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο κλώνος 3#54 μπορούσε να αντιστρέψει την καταστολή της ενεργότητας Τ λεμφοκυττάρων μετά από ομοιοπολική ενεργοποίηση μέσω του CD3 μορίου παρουσία της ανασυνδυασμένης Β7-Η4 πρωτεΐνης. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι το B7-H4 που εκφράζεται in cis από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα ή in trans από ΤΑΜs μειώνει την ενεργοποίηση Τ κυττάρων με ειδικότητα για καρκινικά αντίγονα κατόπιν αναγνώρισης των κυττάρων-στόχων τους. Τo ανασυνδυασμένο αντίσωμα κατά του B7-H4 3#54 από την άλλη, εξουδετερώνει την αρνητική επίδραση του Β7-Η4 προάγοντας την ανοσολογική απόκριση των Τ λεμφοκυττάρων κατά των καρκινικών στόχων ή κυττάρων που παρουσιάζουν τον αντιγονικό επίτοπο. Ανακεφαλαιώνοντας, στην παρούσα εργασία μελετήσαμε τον ρόλο της υπερέκφρασης των γλυκοπρωτεϊνών μεσοθηλίνη, CA125, MR και B7-H4. Οι συγκεκριμένες αποτελούν σημαντικούς διαγνωστικούς και προγνωστικούς δείκτες στον καρκίνο των ωοθηκών. Μελετήσαμε την πρόσδεση αυτών των αντιγόνων σε μακροφάγα ή σε Τ λεμφοκύτταρα και αποκαλύψαμε σημαντικές συνέπειες των αλληλεπιδράσεων αυτών για την ανοσολογική απόκριση έναντι καρκινικών κυττάρων. Τέλος, απομονώσαμε ανασυνδυασμένα αντισώματα έναντι των παραπάνω γλυκοπρωτεϊνών και διερευνήσαμε την εφαρμογή τους σε πειραματικές μελέτες για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μεθόδων στον καρκίνο των ωοθηκών

Overexpression of GPC6 and TMEM132D in Early Stage Ovarian Cancer Correlates with CD8+ T-Lymphocyte Infiltration and Increased Patient Survival

Infiltration of cytotoxic T-lymphocytes in ovarian cancer is a favorable prognostic factor. Employing a differential expression approach, we have recently identified a number of genes associated with CD8+ T-cell infiltration in early stage ovarian tumors. In the present study, we validated by qPCR the expression of two genes encoding the transmembrane proteins GPC6 and TMEM132D in a cohort of early stage ovarian cancer patients. The expression of both genes correlated positively with the mRNA levels of CD8A, a marker of T-lymphocyte infiltration [Pearson coefficient: 0.427 (p=0.0067) and 0.861 (p<0.0001), resp.]. GPC6 and TMEM132D expression was also documented in a variety of ovarian cancer cell lines. Importantly, Kaplan-Meier survival analysis revealed that high mRNA levels of GPC6 and/or TMEM132D correlated significantly with increased overall survival of early stage ovarian cancer patients (p=0.032). Thus, GPC6 and TMEM132D may serve as predictors of CD8+ T-lymphocyte infiltration and as favorable prognostic markers in early stage ovarian cancer with important consequences for diagnosis, prognosis, and tumor immunobattling

Mannose receptor (MR) engagement by mesothelin GPI anchor polarizes tumor-associated macrophages and is blocked by anti-MR human recombinant antibody.

Tumor-infiltrating macrophages respond to microenvironmental signals by developing a tumor-associated phenotype characterized by high expression of mannose receptor (MR, CD206). Antibody cross-linking of CD206 triggers anergy in dendritic cells and CD206 engagement by tumoral mucins activates an immune suppressive phenotype in tumor-associated macrophages (TAMs). Many tumor antigens are heavily glycosylated, such as tumoral mucins, and/or attached to tumor cells by mannose residue-containing glycolipids (GPI anchors), as for example mesothelin and the family of carcinoembryonic antigen (CEA). However, the binding to mannose receptor of soluble tumor antigen GPI anchors via mannose residues has not been systematically studied. To address this question, we analyzed the binding of tumor-released mesothelin to ascites-infiltrating macrophages from ovarian cancer patients. We also modeled functional interactions between macrophages and soluble mesothelin using an in vitro system of co-culture in transwells of healthy donor macrophages with human ovarian cancer cell lines. We found that soluble mesothelin bound to human macrophages and that the binding depended on the presence of GPI anchor and of mannose receptor. We next challenged the system with antibodies directed against the mannose receptor domain 4 (CDR4-MR). We isolated three novel anti-CDR4-MR human recombinant antibodies (scFv) using a yeast-display library of human scFv. Anti-CDR4-MR scFv #G11 could block mesothelin binding to macrophages and prevent tumor-induced phenotype polarization of CD206(low) macrophages towards TAMs. Our findings indicate that tumor-released mesothelin is linked to GPI anchor, engages macrophage mannose receptor, and contributes to macrophage polarization towards TAMs. We propose that compounds able to block tumor antigen GPI anchor/CD206 interactions, such as our novel anti-CRD4-MR scFv, could prevent tumor-induced TAM polarization and have therapeutic potential against ovarian cancer, through polarization control of tumor-infiltrating innate immune cells

Anti-HER2 CAR-transduced T cells recognize all primary and established ovarian cancer cells.

<p><b><i>A</i></b><b>.</b> Schematic representation of Anti-HER2 Chimeric Antigen Receptor (CAR) construct containing the CD3ζ cytosolic domain alone (C6.5-z). C6.5, anti-HER2 scFv; VL, variable light chain; L, Linker; VH, variable heavy chain; TM, transmembrane region. C6.5 scFv CAR expression (gray histograms) was detected on human CD4⁺ and CD8⁺-gated T cells using recombinant human HER2-Fc chimeric protein 10 days after transduction, compared to untransduced T cells (open histograms). Percentage of CAR transduction is indicated. <b><i>B.</i></b> Anti-HER2 CAR transduced T cells produce IFN-γ specifically after stimulation with human ovarian cancer cell lines. CAR transduced or untransduced T cells were cultured alone (none) or stimulated overnight with human HER2⁺ established and short-term ovarian cancer cell lines or HER2⁻ control lines CEM and MDA468. IFN-γ was quantified from cell-free supernatants by ELISA. <b><i>C.</i></b> Anti-HER2 CAR T cells secrete IFN-γ after stimulation by HER2⁺ primary ascites (left) or solid ovarian (middle) tumor cells. Minimal amounts of IFN-γ were detected after stimulation with the normal ovarian surface epithelial cells 398, IOSE-4, IOSE-6 or 1744 (right). Cytokine concentrations (pg/ml) are reported as the mean ± SEM of triplicate wells.</p

Primary Human Ovarian Epithelial Cancer Cells Broadly Express HER2 at Immunologically-Detectable Levels

<div><p>The breadth of HER2 expression by primary human ovarian cancers remains controversial, which questions its suitability as a universal antigen in this malignancy. To address these issues, we performed extensive HER2 expression analysis on a wide panel of primary tumors as well as established and short-term human ovarian cancer cell lines. Conventional immunohistochemical (IHC) analysis of multiple tumor sites in 50 cases of high-grade ovarian serous carcinomas revealed HER2 overexpression in 29% of evaluated sites. However, more sensitive detection methods including flow cytometry, western blot analysis and q-PCR revealed HER2 expression in all fresh tumor cells derived from primary ascites or solid tumors as well as all established and short-term cultured cancer cell lines. Cancer cells generally expressed HER2 at higher levels than that found in normal ovarian surface epithelial (OSE) cells. Accordingly, genetically-engineered human T cells expressing an HER2-specific chimeric antigen receptor (CAR) recognized and reacted against all established or primary ovarian cancer cells tested with minimal or no reactivity against normal OSE cells. In conclusion, all human ovarian cancers express immunologically-detectable levels of HER2, indicating that IHC measurement underestimates the true frequency of HER2-expressing ovarian cancers and may limit patient access to otherwise clinically meaningful HER2-targeted therapies.</p> </div

Normal established and primary ovarian surface epithelial cells (OSE) express HER2 protein and <i>ERBB2</i> mRNA.

<p><b><i>A.</i></b><i> ERBB2</i> mRNA quantitation in normal OSE cells (398, IOSE-4, IOSE-6 and 1744) by q-PCR. SKOV-3 and CEM were used as positive and negative HER2 expressing cell lines respectively. Bars show the mean ± SD value of triplicate wells. <b><i>B.</i></b> Surface HER2 protein expression (solid histograms) by normal ovarian epithelial cells by flow cytometry; isotype antibody control (open histograms). <b><i>C–D.</i></b> Comparison of the <i>ERBB2</i> mRNA and protein levels between ovarian cancer ascites, solid tumor and normal OSE cells. (<b><i>C</i></b>) Vertical scatter plots of the <i>ERBB2</i> mRNA in ascites, solid tumor and normal OSE determined by q-PCR. The mean of each group is indicated by the horizontal line. <i>P</i> = 0.0498 when comparing <i>ERBB2</i> mRNA in ascites vs normal OSE cells; <i>P</i> = 0.0210 when comparing <i>ERBB2</i> mRNA in solid tumors vs normal OSE cells. (<b><i>D</i></b>) Vertical scatter plots of the protein levels in ascites, solid tumor and normal OSE determined by flow cytometry. The mean of each group is indicated by the horizontal line <i>P</i> = 0.0616 when comparing HER2 protein in ascites vs normal OSE cells; <i>P</i> = 0.1749 when comparing HER2 protein in solid tumors vs normal OSE cells. <i>P</i> values were calculated using unpaired student’s t-test analysis.</p

HER2 surface protein expression in established and primary ovarian cell lines.

<p>HER2 is expressed in the cell surface of all ascites and solid tumor-derived tumor cells. HER2 expression was assessed using flow cytometry in a large panel of clinical ascites and solid tumor specimens. A breast cancer cell line (MDA 468) and a leukemia cell line (CEM) which do not express any HER2 were used as negative controls. HER2 was found to be expressed in all tested ascites and solid tumor specimens albeit at different levels. HER2 cell surface levels are expressed as specific MFI. <i>P</i> = 0.03 when comparing percentage of HER2 protein-expressing cells in established vs. short-term lines. <i>P</i> = 0.43 when comparing MFI of HER2 protein detection in established vs. to short-term cell lines. <i>P</i> values were calculated using student’s unpaired t-test analysis.</p

Ubiquitous HER2 expression in ovarian cancer cell lines.

<p><b><i>A.</i></b><i>ERBB2</i> mRNA levels in ovarian cancer cell lines by q-PCR. <i>ERBB2</i> mRNA levels of ovarian cancer cell lines are relative to that of ErbB2-negative CEM cells. All ovarian cancer cell lines express <i>ERBB2</i> mRNA. B-actin was used as an endogenous gene control. Results depict the mean ± SD of triplicate wells. Mean relative <i>ERBB2</i> mRNA expression amongst established and short-term OvCa cell lines was not statistically different (<i>P</i> = 0.45). <i>P</i> value was calculated using unpaired student’s t-test analysis. <b><i>B.</i></b> Detection of surface HER2 protein expression (filled histograms) by human ovarian cancer cell lines by flow cytometry; isotype antibody control (open histograms). <b><i>C.</i></b> Western blot analysis of HER2 protein expression in representative cell lines expressing differential amounts of HER2. HER2 protein is expressed at variable levels in all the ovarian cell lines tested. B-actin was used as control.</p

Ovarian cancer cells stimulate a cytolytic phenotype of anti-HER2 CAR T cells.

<p>C6.5 CAR T cells degranulate and express T cell activation markers in response to HER2-specific stimulation. C6.5 CAR T cells were cultured without target cells (none) or with the indicated HER2-negative or -positive established and primary tumor cell targets or normal OSE cells for 5 h while being stained by an anti-CD107a, b antibody conjugated with FITC. After the incubation period, T cells were stained for CD8 and CD69 and analyzed by flow cytometry.</p