LPIN1 gene mutations: a major cause of severe rhabdomyolysis in early childhood.

International audienceAutosomal recessive LPIN1 mutations have been recently described as a novel cause of rhabdomyolysis in a few families. The purpose of the study was to evaluate the prevalence of LPIN1 mutations in patients exhibiting severe episodes of rhabdomyolysis in infancy. After exclusion of primary fatty acid oxidation disorders, LPIN1 coding sequence was determined in genomic DNA and cDNA. Among the 29 patients studied, 17 (59%) carried recessive nonsense or frameshift mutations, or a large scale intragenic deletion. In these 17 patients, episodes of rhabdomyolysis occurred at a mean age of 21 months. Secondary defect of mitochondrial fatty oxidation or respiratory chain was found in skeletal muscle of two patients. The intragenic deletion, c.2295-866_2410-30del, was identified in 8/17 patients (47%), all Caucasians, and occurred on the background of a common haplotype, suggesting a founder effect. This deleted human LPIN1 form was unable to complement ∆pah1 yeast for growth on glycerol, in contrast to normal LPIN1. Since more than 50% of our series harboured LPIN1 mutations, LPIN1 should be regarded as a major cause of severe myoglobinuria in early childhood. The high frequency of the intragenic LPIN1 deletion should provide a valuable criterion for fast diagnosis, prior to muscle biopsy

Étude des rôles et des partenaires du domaine C terminal de Rpn11, une sous-unité du protéasome 26S, dans la dynamique mitochondriale chez Saccharomyces cerevisiae.

Les mitochondries sont des organites semi autonomes, capables d autoréplication, qui varient en nombre, en taille et en forme dans le cytoplasme de presque toutes les cellules eucaryotes. Elles sont notamment connues pour être les fournisseurs d énergie de la cellule. Afin de mener à bien ce rôle, les mitochondries sont capables de fusionner et de se diviser, ce qui permet un contrôle de la forme du réseau mitochondrial. Le contrôle de ces évènements et la forme du réseau qui en résulte sont connus sous le nom de dynamique mitochondriale. Cette dynamique répond à de nombreux stimuli cellulaires et est très régulée. Récemment, il a été montré que le système ubiquitine-protéasome régule la fusion des mitochondries et qu une des sous unités du protéasome contrôlait la fission des mitochondries. Le système ubiquitine-protéasome est un mécanisme qui repose sur plusieurs acteurs : les enzymes qui vont reconnaître les protéines cibles de ce système, une protéine appelée ubiquitine qui sert pour le marquage des protéines cibles et un complexe multi-protéique appelé protéasome effecteur de la dégradation des protéines cibles. Connu uniquement à l origine pour son rôle dans la dégradation des protéines cibles, il est apparu dans les dernières années que le rôle de ce système ou de ses composants en dehors de ce système était bien plus vaste. Les études effectuées au laboratoire avaient déjà montré que Rpn11, une sous-unité du protéasome, régulait la fission des mitochondries indépendamment de l activité protéolytique du protéasome. Le travail présenté ici porte sur le mécanisme d action du domaine C-terminal de Rpn11 sur divers processus cellulaires tels que l assemblage du protéasome, la régulation de la fission des mitochondries et des peroxysomes, la longévité cellulaire ou la formation de Proteasome Storage Granule . Ce manuscrit présente aussi le travail effectué pour trouver les partenaires qui permettent la régulation de la fission des mitochondries avec le domaine C-terminal de Rpn11 ainsi que l étude de la localisation in vivo de Rpn11.Mitochondria are semi-autonomous organelles, which size, shape and number vary in a wide range in almost every eukaryotic cell. They are famous to be the energy producer of the cells. For this purpose, mitochondria are able to fuse and divide. These events of fusion and fission are also known as the mitochondrial dynamic. This phenomenon is highly controlled and answers to many stimuli. Lately, it has been shown that the ubiquitin proteasome system controls the fusion of mitochondria and that a proteasome subunit controls the mitochondrial fission. The ubiquitin proteasome system is a mechanism that relies on many actors: enzymes recognizing the targets of this system, a protein called ubiquitin and a complex called proteasome in charge of the degradation of the targets. Primarily known for the protein degradation, many investigations suggest that this system has other roles. Our previous studies had already shown that the proteasome subunit named Rpn11 controls the fission of mitochondria independently of the proteolytic activities of the proteasome system. The work shown in this manuscript is focused on the mechanism of action of the C-terminus domain of Rpn11 on various cellular processes, including proteasome assembly, control of mitochondrial and peroxisomal fission, yeast lifespan and also the Proteasome Storage Granule formation. The in vivo localisation of Rpn11 and the elucidation of its partners on the mitochondrial fission regulation were also investigated.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Etude du rôle d'une sous-unité essentielle de la particule régulatrice du protéasome 26S dans la dynamique de deux organelles chez la levure Saccharomyces cerevisiae

Les mitochondries sont des organelles essentielles à la vie. Elles sont en perpétuel mouvement et des événements de fusion et fission des membranes gouvernent la dynamique mitochondriale. L'objectif de ma thèse a été d'élucider le rôle d'une sous-unité essentielle du protéasome (Rpn11) sur la dynamique mitochondriale. Le protéasome, responsable de la dégradation des protéines ubiquitinées, joue un rôle majeur dans un grand nombre de fonctions cellulaires dont la fusion mitochondriale. Cependant, de par son aspect modulaire, il a été clairement établi que son activité n'est pas réduite à la dégradation des protéines. Le protéasome joue aussi un rôle crucial dans différents mécanismes, indépendamment de son activité de dégradation. Mes travaux ont permis de proposer une nouvelle fonction non protéolytique associée au protéasome. La caractérisation des défauts d'une souche mutée dans RPN11 (fragmentation mitochondriale, augmentation anormale du nombre de peroxysomes) nous a permis de mettre en évidence que Rpn11 régule l'appareil de fission commun aux mitochondries et aux peroxysomes (Fis1/Mdv1/Dnm1). L'analyse des phénotypes de différents allèles mutants de RPN11 a révélé un domaine fonctionnel C-terminal indépendant du domaine N-terminal. Ce domaine C-terminal est essentiel au maintien du génome mitochondrial et de la morphologie mitochondriale. Enfin, nous avons démontré, grâce à l'étude quantitative des peroxysomes dans différents contextes génétiques, que Rpn11 régule la fission des peroxysomes et des mitochondries de manière Fis1 dépendante, en dehors de son activité de déubiquitination et indépendamment de l'activité de dégradation du protéasome.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Identification of new nuclear genes invoolved in the mitochondrial genome maintenance

Sous le terme de maladies mitochondriales, on désigne des maladies multi-systémiques ou à expression tissu-spécifique dues à un déficit de la phosphorylation oxydative qui est assurée par le fonctionnement de 5 complexes protéiques enzymatiques (chaîne respiratoire) parmi lesquelles 13 sous-unités sont codées par le génome mitochondrial, les autres par le génome nucléaire. Ces pathologies recouvrent donc en pratique des maladies génétiques par mutation de l ADN mitochondrial (ADNmt) mais aussi des maladies génétiques à hérédité mendélienne classique. Dans les cytopathies mitochondriales liées à des mutations de gènes nucléaires, il existe deux sortes de gènes (i) à effet direct correspondant à des gènes codant pour les sous-unités protéiques de la chaîne respiratoire ou leur assemblage, et (ii) à effet indirect correspondant à des gènes codant pour des protéines impliquées dans le maintien et la réplication de l'ADN mitochondrial. Des mutations dans cette dernière classe de gènes peuvent s'accompagner d'anomalies quantitatives ou qualitatives de l'ADNmt : déplétion de l'ADNmt (réduction majeure du nombre de molécules d'ADNmt) et délétions multiples.Après des dosages enzymatiques de l activité des complexes respiratoires mitochondriaux chez les patients, le ou les types de complexes altérés sont connus. Un grand nombre de gènes mutés responsables de pathologies mitochondriales ont été identifiés, tous codant des constituants des différents complexes de la chaîne respiratoire. Ces dernières années, le groupe d Agnès Rötig (Hôpital Necker, Paris) a identifié de nouveaux gènes grâce à une approche gènes candidats ou grâce à des tours de génome de familles consanguines de patients qui permettent de délimiter une région chromosomique portant la mutation à l état homozygote. La validation de l effet délétère de la mutation identifiée se fait en général en utilisant des organismes modèles d étude comme les cellules humaines en culture ou bien la levure. Cependant, il reste un grand nombre de cas où la mutation n a pas pu être identifiée, soit parce que le déficit de tel ou tel complexe ne met pas en jeu un des composants connus de ce complexe ou bien plusieurs complexes de la chaîne respiratoire sont déficitaires mettant en jeu, dans un grand nombre de cas, le maintien de l ADN mitochondrial pour lequel peu de gènes sont connus.Au laboratoire d Orsay, nous disposons de deux organismes modèles d étude, la levure S. cerevisiae et le nématode C. elegans. La levure S. cerevisiae est l organisme modèle de choix pour étudier les fonctions mitochondriales grâce à ses caractéristiques comme la respiration facultative, mais aussi et surtout par la puissance de sa génétique et le fait que les mitochondries peuvent être transformées. Cependant de par sa respiration facultative et sa division clonale, elle ne se prête pas facilement à des études sur la stabilité de l ADNmt. En effet, S. cerevisiae perd très facilement son ADNmt après inactivation d un grand nombre de gènes impliqués dans pratiquement toutes les voies de la biogenèse mitochondriale. Cette levure ne peut donc pas être utilisée de façon simple pour l étude de la transmission de l ADN mitochondrial. C est pourquoi nous nous sommes alors intéressés à l autre organisme modèle développé au laboratoire, le nématode C. elegans dont ses caractéristiques en font un excellent modèle complémentaire à la levure. Chez l homme, la diminution du nombre de copies de l ADN mitochondrial (ADNmt ; syndrome de déplétion) provoquée par des mutations nucléaires est à l origine de nombreuses pathologies chez l homme et est dramatique pour l enfant puisque l intégrité du génome mitochondrial est essentielle à la viabilité cellulaire. D un point de vue fondamental, le maintien, la stabilité et la transmission du génome mitochondrial sont des processus peu connus et complexes et la plupart des acteurs moléculaires régulant la stabilité de l ADNmt sont encore inconnus notamment chez les organismes pluricellulaires. À l heure actuelle, des mutations dans 9 gènes différents ont été rapportées codant deux protéines de la réplication de l ADNmt (POLG et TWINKLE) ou bien codant des protéines intervenant dans le pool mitochondrial de dNTP. Cependant pour un grand nombre de patients de la cohorte de Necker, les gènes connus ont été exclus et le gène incriminé est encore inconnu. C est pourquoi il nous est apparu extrêmement important de tenter de trouver une méthode pour identifier de nouveaux gènes qui contrôlent la stabilité du génome mitochondrial. Nous avons réussi à mettre au point ce projet.Mitochondrial respiratory chain diseases of nuclear origin represent one of the major causes of metabolic disorders. These diseases are characterized by a huge clinical and genetic heterogeneity which is a major problem in identifying the disease causing gene. Although several gene mutations have already been found in some patients or families, the disease causing gene of the majority is yet to be determined. The overall structure and gene content of the mitochondrial genome and the proteins required for mtDNA transactions are largely conserved from yeast to human offering the opportunity to use animal models to understand the molecular basis of mitochondrial dysfunctions. To expand the number of human candidate genes of mitochondrial diseases involved in mtDNA maintenance, we have developed in this study, the nematode Caenorhabditis elegans as a model organism to identify new proteins involved in mtDNA maintenance by combining RNAi and ethidium bromide exposure. We have developed a large-scale screening method of genes required for mtDNA maintenance in the worm and initially indentified four new C. elegans genes (atad-3, dnj-10, polrmt, phi-37 and immt-1) involved in mtDNA stability. The human homologs of these genes (ATAD3, DNAJA3, POLRMT and ATP5A1) can be now considered as candidate genes for patients with quantitative mtDNA deficiencies. Using our screening design we have begun to screen all the C. elegans genes encoding mitochondrial proteins. Of the 721 estimated C. elegans mitochondrial genes homologous to human genes, we have tested 185 genes and found that 41 genes are required for the maintenance of the mitochondrial genome in post mitotic cells. These genes fall into three main functional categories of metabolism, protein synthesis and oxidative phosphorylation. Finally, in this study, we investigated the reversibility of mtDNA depletion with drugs to counteract POLG dificiency. Three molecules, Chlorhexidine, Resveratrol and Bezafibrate, have been tested to restore normal mtDNA content and worm life cycle. These experiments hold promise for future work using C. elegans as a pharmacological model for mitochondrial diseases.Altogether, the data generated in this work is a starting point for promising advances in the mitochondrial field, showing the relevance of the nematode as a model organism to study fundamental processes as well as human health research.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Solubilization and insertion into reverse micelles of the major myelin transmembrane proteolipid

AbstractThe Folch-Pi proteolipid has been isolated from bovine white matter and characterized with respect to phospholipid and glycolipid composition. The protein-lipid complex has been solubilized in aqueous reverse micelles of di(2-ethylhexyl) sodium sulfosuccinate and isooctane. Solubilization of this otherwise water-insoluble proteolipid requires small amounts of water, the percent of solubility being maximum for a low molar ratio of water to surfactant (Wo = 5.6). Unlike hydrophilic proteins, the extent of incorporation into the micellar system is negligible at 50 mM surfactant and reaches 90Vo only at 300 mM. However, the conformation of the proteolipid in reverse micelles as studied by fluorescence emission spectroscopy and circular dichroism was not affected by variations of the surfactant concentration. These results are consistent with the peculiar properties of the aqueous environment of the proteolipid within the reverse micelles and may reflect the membrane-like character of these bio-assemblies

Contribution of ERMES subunits to mature peroxisome abundance

International audienceEukaryotic organelles share different components and establish physical contacts to communicate throughout the cell. One of the best-recognized examples of such interplay is the metabolic cooperation and crosstalk between mitochondria and peroxisomes, both organelles being functionally and physically connected and linked to the endoplasmic reticulum (ER). In Saccharomyces cerevisiae, mitochondria are linked to the ER by the ERMES complex that facilitates inter-organelle calcium and phospholipid exchanges. Recently, peroxisome-mitochondria contact sites (PerMit) have been reported and among Permit tethers, one component of the ERMES complex (Mdm34) was shown to interact with the peroxin Pex11, suggesting that the ERMES complex or part of it may be involved in two membrane contact sites (ER-mitochondria and peroxisome- mitochondria). This opens the possibility of exchanges between these three membrane compartments. Here, we investigated in details the role of each ERMES subunit on peroxisome abundance. First, we confirmed previous studies from other groups showing that absence of Mdm10 or Mdm12 leads to an increased number of mature peroxisomes. Secondly, we showed that this is not simply due to respiratory function defect, mitochondrial DNA (mtDNA) loss or mitochondrial network alteration. Finally, we present evidence that the contribution of ERMES subunits Mdm10 and Mdm12 to peroxisome number involves two different mechanisms

Combined use of Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans and patient fibroblasts leads to the identification of clofilium tosylate as a potential therapeutic chemical against POLG-related diseases

Mitochondria are organelles that have their own DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) whose maintenance is necessary for the majority of ATP production in eukaryotic cells. Defects in mtDNA maintenance or integrity are responsible for numerous diseases. The DNA polymerase γ (POLG) ensures proper mtDNA replication and repair. Mutations in POLG are a major cause of mitochondrial disorders including hepatic insufficiency, Alpers syndrome, progressive external ophthalmoplegia, sensory neuropathy and ataxia. Mutations in POLG are also associated with parkinsonism. To date, no effective therapy is available. Based on the conservation of mitochondrial function from yeast to human, we used Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans as first pass filters to identify a chemical that suppresses mtDNA instability in cultured fibroblasts of a POLG-deficient patient. We showed that this unsuspected compound, clofilium tosylate (CLO), belonging to a class of anti-arrhythmic agents, prevents mtDNA loss of all yeast mitochondrial polymerase mutants tested, improves behavior and mtDNA content of polg-1-deficient worms and increases mtDNA content of quiescent POLG-deficient fibroblasts. Furthermore, the mode of action of the drug seems conserved as CLO increases POLG steady-state level in yeast and human cells. Two other anti-arrhythmic agents (FDA-approved) sharing common pharmacological properties and chemical structure also show potential benefit for POLG deficiency in C. elegans. Our findings provide evidence of the first mtDNA-stabilizing compound that may be an effective pharmacological alternative for the treatment of POLG-related diseases

Integrity of the Saccharomyces cerevisiae Rpn11 protein is critical for formation of proteasome storage granules (PSG) and survival in stationary phase.

Decline of proteasome activity has been reported in mammals, flies and yeasts during aging. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the reduction of proteolysis in stationary phase is correlated with disassembly of the 26S proteasomes into their 20S and 19S subcomplexes. However a recent report showed that upon entry into the stationary phase, proteasome subunits massively re-localize from the nucleus into mobile cytoplasmic structures called proteasome storage granules (PSGs). Whether proteasome subunits in PSG are assembled into active complexes remains an open question that we addressed in the present study. We showed that a particular mutant of the RPN11 gene (rpn11-m1), encoding a proteasome lid subunit already known to exhibit proteasome assembly/stability defect in vitro, is unable to form PSGs and displays a reduced viability in stationary phase. Full restoration of long-term survival and PSG formation in rpn11-m1 cells can be achieved by the expression in trans of the last 45 amino acids of the C-terminal domain of Rpn11, which was moreover found to co-localize with PSGs. In addition, another rpn11 mutant leading to seven amino acids change in the Rpn11 C-terminal domain, which exhibits assembled-26S proteasomes, is able to form PSGs but with a delay compared to the wild type situation. Altogether, our findings indicate that PSGs are formed of fully assembled 26S proteasomes and suggest a critical role for the Rpn11 protein in this process