Polymer-drug conjugates as platforms for combination therapy in the treatment of hormone-dependent breast cancer

1. Objetivos de la Investigación. Los conjugados poliméricos son nanoconstrucciones multicomponente presentes actualmente en clínica como terapia anticancerígena, tanto como agentes únicos, como formando parte de combinaciones. Estos nanoconjugados tienen el potencial de mejorar farmacológicamente el tratamiento de tumores sólidos, debido a una acumulación pasiva en el tumor (efecto ‘EPR’) y a un diferente mecanismo de internalización celular y posterior liberación del fármaco(s). La transferencia de conjugados polímero-proteína a uso clínico rutinario, y el desarrollo clínico de conjugados polímero-fármaco anticancerígeno sitúa a los conjugados poliméricos como una de las primeras clases de nanomedicinas con potencial terapéutico antitumoral ya demostrado. La experiencia obtenida con los primeros nanoconjugados en clínica, ha proporcionado las bases para el desarrollo de polímeros conjugados más sofisticados de segunda generación con propiedades terapéuticas mejoradas. El desarrollo de nuevos portadores poliméricos biodegradables con propiedades mejoradas, la utilización de terapia de combinación o el diseño de conjugados dirigidos a nuevas dianas moleculares son algunas de las aproximaciones a seguir para conseguir conjugados más específicos y efectivos considerados de segunda generación. La propiedad de multivalencia que poseen los polímeros nos permite la conjugación de varios compuestos activos en el mismo esqueleto polimérico, la combinación del modulador activo con un citotóxico, otra sustancia activa o un residuo dirigente puede aumentar marcadamente el valor terapéutico de estas macromoléculas. En este sentido, el punto de partida de la presente propuesta es un nuevo concepto establecido por nosotros en 2005 con el desarrollo de HPMA copolimero-AGM-Dox, basado en la terapia de combinación (terapia endocrina + quimioterapia dentro de la misma matriz polimérica) para el tratamiento de cáncer de mama hormono-dependiente (Vicente et al., 2005). El valor terapéutico de esta nueva estrategia ha sido previamente demostrado en modelos celulares, lo que implicaría una clara aplicación potencial en el tratamiento de tumores hormono-dependientes en mujeres postmenopáusicas. En el presente proyecto, se plantea corroborar la actividad antitumoral del nanoconjugado de combinación HPMA copolimero-AGM-Dox utilizando modelos in vivo, así como elucidar las bases moleculares responsables de su destacada actividad anticancerígena. La comprensión del mecanismo de acción molecular nos permitirá el diseño futuro de nanoconjugados de combinación con propiedades mejoradas. En una segunda etapa se propone mejorar el valor terapéutico de esta nueva terapia de combinación mediante la utilización de un polímero biodegradable como portador, ácido poli-L-glutámico (PGA), desarrollando un nuevo conjugado de combinación PGA-AGM-Dox y evaluando su actividad antitumoral en modelos in vitro e in vivo. La etapa final de la presente tesis doctoral consiste en el desarrollo de un cribado farmacológico utilizando 5 quimio agentes y 3 agentes de terapia hormonal para evaluar su actividad citotóxica en las líneas celulares de cáncer de mama con el objetivo de seleccionar una combinación sinérgica de fármacos con mayor potencial citotóxico que AGM-DOX, que sirva de base para el desarrollo de futuras terapias de combinación. 1.1. Antecedentes. Para comprobar la hipótesis de partida se desarrolló un conjugado modelo HPMA copolímero-AGM-Dox que transporta una combinación de terapia endocrina (inhibidor de aromatasa (AGM) y quimioterapia (Dox) para el tratamiento de cáncer de mama (figura 1.) (Greco, et al., 2005; Vicent et al., 2005; Greco et al., 2006). Su diseño se basó en dos observaciones principalmente: (i) el copolímero HPMA copolímero-Dox (PK1, FCE28068) es un conjugado en fase clínica II con demostrada actividad en pacientes con tumores de mama quimioresistentes (Vasey et al., 1999) y (ii) los inhibidores de aromatasa pueden actuar de forma sinergíca con quimioterapia (Johnston and Dowsett, 2003). La elección de AGM (inhibidor de aromatasa de primera generación) se debió principalmente a que presenta una funcionalización adecuada para ser conjugado al polímero y está disponible comercialmente, por tanto, AGM fue considerado como el fármaco adecuado en esta primera fase de prueba de concepto (Goss and Strasser, 2001; Pool and Paridaens, 2007). Figura 1. Estructura del conjugado de combinación HPMA copolímero-AGM-Dox. El conjugado de combinación (HPMA copolímero-AGM-Dox) mostró un aumento muy marcado de citotoxicidad frente a modelos celulares de cáncer de mama positivos en receptores de estrógenos (ER+) (MCF7 y MCF7 Ca (transfectada de forma estable con el gen humano aromatasa (Yue et al., 1994)) en comparación a la actividad citotóxica obtenida con los conjugados individuales por separado (HPMA copolímero-Dox) o una mezcla simple de ambos (HPMA copolímero-Dox + HPMA copolímero-AGM) (Figura 2). Además, experimentos llevados a cabo con una familia de conjugados sintetizados que contienen AGM (los primeros conjugados con terapia endocrina descritos), confirmaron que era necesaria la liberación de AGM para conseguir la inhibición del enzima aromatasa (Greco et al., 2005; Greco et al., 2007). Figura 2. Comparación de la actividad citotoxica de HPMA copolímero-AGM-Dox y mezcla de conjugados simples en células MCF7 (Panel a) y en células MCF7 Ca (panel b). Dox; HPMA copolímero-AGM-Dox; HPMA copolímero-Dox + HPMA copolímero-AGM; HPMA copolímero-Dox. En una segunda fase se evaluó el mecanismo de acción de HPMA copolímero-Dox y HPMA copolímero-AGM-Dox para entender el efecto sinérgico de citotoxicidad únicamente observable cuando los dos fármacos se hallan covalentemente unidos a la misma matriz polimérica. En este sentido, se analizaron exhaustivamente las diferencias en el tráfico intracelular (unión e internalización celular, mecanismo de endocitosis con diferentes inhibidores de rutas endocíticas y fagocitosis) y en la cinética de liberación de fármaco (transporte lisosomotrópico) (Greco et al., 2005; Vicent et al., 2005; Greco et al., 2006). Figura 3. Perfil de liberación de Dox y AGM de los diferentes conjugados de HPMA en presencia de enzimas lisosomales de rata (tritosomas). Por otra parte, estudios preliminares de posibles diferencias en el mecanismo de acción molecular también se realizaron mediante técnicas de immunohistoquímica (Greco et al., 2007). Los resultados obtenidos sugieren que el aumento de actividad obtenido con el conjugado de combinación es debido principalmente a la diferente cinética de liberación intracelular de los fármacos (Figura 3). Al hallarse en la misma matriz polimérica poseen un perfil de liberación distinto en comparación a los conjugados simples, este cambio en la cinética de liberación induce un aumento de apoptosis celular en las células MCF7 y MCF7 Ca a través de la disminución de la proteína anti-apoptótica Bcl-2 (Greco et al., 2007). De los datos obtenidos hasta ese momento, era evidente que el conjugado de combinación HPMA copolímero-AGM-Dox muestra un aumento en la actividad antitumoral in vitro y que mecanismos moleculares complejos parecen ser los responsables de este efecto sinergístico. Esta aproximación nos ofrece, claramente, una nueva oportunidad para el tratamiento de cáncer de mama metastático quimioresistente. Además de aumentar la actividad del citotóxico, esta plataforma tecnológica es de aplicación sistémica intravenosa (muy adecuada para el tratamiento de metástasis con elevada angiogénesis) y su mecanismo de internalización celular es diferente evitando mecanismos de resistencia como la sobreexpresión de la p-glicoproteína en membrana celular. En consecuencia, a la vista de los resultados preliminares obtenidos con HPMA copolimero-AGM-Dox como potente agente antitumoral en modelos in vitro, en este proyecto de tesis doctoral se pretende (i) completar el estudio del mecanismo de acción molecular del conjugado de combinación HPMA copolímero-AGM-Dox y evaluar su potencial terapéutico en modelos animales. De este modo podríamos definir el potencial antitumoral de esta terapia de combinación polimérica para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama. La especificidad tumoral debido al efecto EPR depende de la concentración en plasma del polímero circulante, de este modo, portadores poliméricos no-biodegradables tales como el copolímero HPMA o polietilenglicol (PEG) (Mw<40 000 g/mol para asegurar una eliminación renal efectiva), tienen un perfil farmacocinético menos favorable. Por este motivo, una vez demostrada la actividad in vivo del conjugado HPMA copolímero-AGM-Dox se propone (ii) mejorar el valor terapéutico de esta nueva terapia de combinación mediante la utilización de un polímero biodegradable como portador, ácido poli-L-glutámico y finalmente (iii) el desarrollo de un cribado farmacológico utilizando 5 quimio agentes y 3 agentes de terapia hormonal en las líneas celulares MCF7 y MDA-MB 321 con el objetivo de seleccionar una combinación sinérgica de fármacos con mayor potencial citotóxico, que sirva de base para el desarrollo de futuros polímeros de conjugados. 2. Metodología. 2.1. Síntesis de conjugados. 2.1.a. PGA-OSucc síntesis y purificación. Para la síntesis de PGA-AGM, se requiere la activación previa de los grupos carboxílicos. Debido a la pobre reactividad de la amina aromática AGM, una clásica activación de diimida no fue suficiente para el acoplamiento. Los grupos carboxílicos de PGA fueron activados primero por grupo succinimico. PGA (3,55 mmol, 471.4 mg) se disolvió en di-metil-formamida (DMF) anhidra (5 mL), los grupos succínicos (2,33 mmol, 268.4 mg) se añadió hasta alcanzar un máximo del 60% de la activación del grupo carboxílico. Cuando el medio de reacción era completamente transparente, N, N'-diisopropil carbodiimine (DIC) (2,33 mmol, 350 μL) y una cantidad catalítica de 4, dimetilaminopiridina (DMAP) fueron añadidos. La reacción se dejó durante 36 h. El DMF se evaporó por alto vacío y el PGA-OSucc se precipitó por Chloroformo (CHCl3) / acetona (4/1). El producto se purificó mediante lavado con éter (x3) en baño de ultrasonidos (5 min cada uno). El rendimiento fue de 77% y la tasa de activación fue de 41%. 2.1.b. PGA-AGM síntesis y purificación. PGA-OSucc (0,52 mmol, 91,3 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), a continuación, AGM (0,026 mmol, 6 mg) y una cantidad catalítica de DMAP fue añadida. El pH se controló y se ajustó con N, N-diisopropiletilamina (DIEA) a pH 8. La reacción se dejó reaccionar durante 36 h a temperatura ambiente (RT). El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado se precipitó con acetato de etilo (AcOEt) / acetona 4/1 a 4 ° C. PGA-AGM sal sódica se realizó mediante la adición de bicarbonato de sodio (NaHCO3) 1 M (0,58 mmol, 285 μL). La etapa de purificación por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se llevó a cabo con el fin de evitar el exceso de sal y el resto de productos que no habían reaccionado. Si una cantidad de DMAP libre se detectó por UV, una diálisis frente a H2O se realizó. Después de la liofilización, el rendimiento de la reacción fue del 60% (60 mg). 2.1.c. PGA-G-AGM síntesis y purificación. Para realizar PGA-G-AGM, se require la síntesis previa de G-AGM. G-AGM: Fluorenilmetiloxicarbonilo glicina (Fmoc-G) (0,65 mmol, 193,24 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL). La activación con DIC (0,975 mmol, 153 μL) se realizó durante 5 min y después se añadió el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (0,975 mmol, 132 mg). Después de 10 minutos, AGM (0,65 mmol, 147 mg) fue finalmente añadido. El pH se controló y se ajustó a pH 8 con DIEA. La reacción se dejó reaccionar durante 36 h a temperatura ambiente. El DMF se evaporó a vacío elevado y Fmoc-G-AGM se purificó por extracción liq / liq. Fmoc-G-AGM se disolvió en AcOEt (10 mL) y se extrajo con NaHCO3 (3x10 mL). A continuación la fase orgánica se lavó con ácido clorhídrico (HCl) 1 M (3x10 mL), se secó sobre sulfato de sodio (Na2 (SO4)) y se evaporó para producir 90% de un producto blanco. La etapa de desprotección se realizó con piperidina al 20% en AcOEt durante 1 h. La purificación del producto se realizó por columna C18. Las condiciones cromatografías iniciales fueron: agua (H2O) / acetonitrilo (ACN) (30:70). La purificación se controló por TLC (G-AGM Rf: 0, Fmoc Rf: 0,83 con hexano: EtOAc 1:4). El protocolo de detección utilizizado fue doble: UV y tinción Nihindrina. El rendimiento de la reacción fue del 70% (0,46 mmol, 125 mg). PGA-G-AGM: La síntesis de PGA-G-AGM se realizó mediante el siguiente protocolo. PGA (0,51 mmol, 80,3 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), DIC (0,808 mmol, 126,2 µL) fue añadido y después de 5 min HOBt (0,808 mmol, 109 mg). Después de la activación de los grupos de ácido carboxílico por DIC y HOBt, G-AGM (0,0269 mmol, 7,8 mg) se añadió. El pH se controló y se ajustó a pH 8 con DIEA. La reacción se monitorizó por TLC y se dejó reaccionar 36 h a temperatura ambiente. El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado de fármaco se precipitó por CHCl3/Acetone 4/1 a 4 ° C con agitación media hora y media hora sin agitación. PGA-G-AGM sal de sodio se obtiene mediante la adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 μL). La etapa de purificación (Diálisis y columna G25) se llevó a cabo con el fin de evitar el exceso de sal y eliminar el fármaco libre. Después de la liofilización, el rendimiento de la reacción fue del 60%. 2.1.d. PGA-GG-AGM síntesis y purificación. En este caso, la síntesis previa de GG-AGM también era necesaria, sin embargo Fmoc-GG no estaba disponible comercialmente, por lo tanto Fmoc-GG se sintetizó en un paso anterior. Fmoc-GG: GG (0,28 mmol, 37,8 mg) se disolvió en una solución de NaHCO3 (10%) (1,6 mL), después se añadió dioxano (0,9 mL) y la reacción se enfrió en hielo. Una vez alcanzada la temperatura adecuada, cloruro de fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc-Cl) (0,28 mmol, 80 mg) fue cuidadosamente añadido gota a gota. La reacción se dejó reaccionar durante 4 horas en un baño de hielo y durante la noche a temperatura ambiente. Fmoc-GG se purificó por extracción liq / liq. La fase acuosa se extrajo con AcOEt (3x5 mL), a continuación seacidificó con HCl (1 M) hasta pH 2 y se extrajo con EtOAc (3x5 mL). La fase orgánica se recogió, se secó sobre Na2 (SO4) y se evaporó para producir 81% de un producto blanco. La síntesis GG-AGM y PGA-GG AGM-se llevaron a cabo siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente para G-AGM y PGA-G-AGM. 2.1.e. PGA-DOX síntesis y purificación. PGA (0,51 mmol, 80,3 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), a continuación, DIC (0,808 mmol, 126,2 µL) fue añadido y después de 5 min HOBt (0,808 mmol, 109 mg) se añadió también como sólido. Después de 10 min, Dox.HCl (0,0269 mmol, 14 mg) se añadió. El pH se controló y se ajustó a pH 8 con DIEA. La reacción se controló por TLC y se dejó reaccionar durante 36 h a temperatura ambiente (TA). DMF se evaporó mediante vacío elevado y el polímero conjugado de droga se precipitó usando CHCl3/Acetone 4 / solución de 1 hora a 4 ° C con agitación y media hora sin agitación media. PGA-Dox sal de sodio se obtuvo por adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 μL). La purificación se realizó del mismo modo que los conjugados PGA-X-AGM. 2.1.f. PGA-G-Dox síntesis y purificación. G-Dox: Bz-G (0,083 mmol, 31,8 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL), a continuación se adicionó DIC (0,124 mmol, 20 μL) y después de 5 min HOBt (0,124 mmol, 22 mg) se añadió también como sólido. Después de 10 min de activación, Dox, HCl (0,083 mmol, 45,5 mg) fue finalmente incorporado. El pH se controló y se ajustó con DIEA para conseguir pH 8. La reacción se dejó reaccionar durante 36 h a TA. El DMF se evaporó a vacío elevado. El gránulo seco se disolvió en MeOH y la purificación se realizó por cromatografía RP-(C18) con 10 mL de 2-propanol/H2O (12:88) (v / v), 10 mL de 2-propanol/H2O (29 : 71) (v / v) y luego 20 mL de MeOH (pH 3,2). El procedimiento de purificación se controló por TLC a través de un sistema de detección de doble fijado en λ = 254 nm y λ = 366 nm. Entonces, la desprotección se llevó a cabo en H2 Pd / Cact durante la noche. La solución se filtró a través de celita y con un filtro de 0,2 micras. Después de la eliminación de MeOH, con un rendimiento de 50% fue alcanzada. PGA-G-Dox se sintetizó siguiendo el mismo procedimiento utilizado para PGA-Dox. 2.1.g. PGA-GG-Dox síntesis y purificación. La síntesis de GG-Dox y PGA-GG-Dox se llevaron a cabo siguiendo el protocolo descrito para el G-Dox y PGA-Dox, respectivamente. 2.1.h. síntesis y purificación de los conjugados de combinación. PGA-AGM-Dox:PGA-OS (0,259 mmol, 85,45 mg) se disolvió en DMF anhidro (5 mL). Una cantidad catalítica de DMAP se añadió y el pH se ajustó a 8 con DIEA. A continuación se adicionó, AGM (0,027 mmol, 6.3mg). La reacción se controló por TLC y se dejó reaccionar durante 36 h a TA. Entonces se añadió DIC (0,036 mmol, 5,7 µL) y después de 5 min HOBt (0,036 mmol, 4.9 mg). Después de la activación de los grupos de ácido carboxílico por DIC y HOBt, se añadió a continuación Dox (0,024 mmol, 13,6 mg), se ajustó el pH a 8 con DIEA y la reacción se dejó reaccionar durante 36 h más a TA. El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado precipitó por adición de 5 mL de CHCl3: acetona (1:1). PGA-AGM-Dox sal sódica se obtuvo mediante la adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 μL). La purificación se realizó del mismo modo que los conjugados PGA-X-AGM. PGA-X-AGM-Y-Dox: El PGA se disolvió en DMF anhidro (5 mL). DIC (1,5 eq de X-AGM) se añadió y, después de 5 min el HOBt (1,5 eq de X-AGM). Siguiendo a la activación de los grupos ácido carboxílico mediante DIC y HOBt, se añadió X-AGM, el pH se ajustó a 8 con DIEA y la reacción se dejó reaccionar durante 36 h a TA. El DMF se evaporó a vacío elevado y el polímero conjugado precipitó por adición de 5 mL de CHCl3: acetona (1:1). PGA-X-AGM-Y-Dox sal sódica se obtuvo mediante la adición de NaHCO3 1 M (0,51 mmol, 250 μL). La purificación se realizó del mismo modo que los conjugados PGA-X-AGM. 2.2. Caracterización de los conjugados 2.2.a. Determinación de la carga de fármaco total y el contenido de fármaco libre en el conjugado sintetizado. X-AGM y AGM fueron utilizados como un estándar para producir una curva de calibración. Se disolvió en MeOH grado HPLC para tener una solución stock de 1 mg/mL. Este se diluyó entonces para producir una gama de concentración (0-65 µg/mL para AGM y 0-65 µg/mL de X-AGM). La absorbancia UV de cada muestra se determinó entre 200-400 nm. La otra posibilidad para evaluar la cantidad total de carga de fármaco consiste en la cuantificación del fármaco que no ha reaccionado. El primer paso fue realizar la curva de calibración de HPLC utilizando las soluciones añadidas para la curva de calibración UV. A continuación, el precipitado de AcOEt/acetona (4/1) obtenido después de la precipitación del polímero conjugado de fármaco, se evaporó, se disolvió en 10 mL de HPLC, y se inyectó en HPLC. La carga de fármaco se determinó de manera indirecta usando RP18 columna (125x4mm), con un flujo de 1mL/min y usando un gradiente de elución [A: H2O +0,1% TFA milliQ, disolvente B: ACN +0,1% TFA]. El tiempo total de análisis fue de 25 min y con el gradiente siguiente: t = 0 A 90%, t = 4 Un 90%, t = 19 A 10%, t = 21 A = 90%, t = 25 A = 90%, t = 40 A 0%, t = 42 A 0%. Un estándar interno (estradiol) se usó para la cuantificación del AGM. El tiempo de retención fue de 2 min para GG-AGM, 6 min para G-AGM y 5 min para AGM. Para evaluar la carga de fármaco libre, 100 µL de una concentración conocida de polímero conjugado de fármaco se añadió con 100 µL de bicarbonato sódico y 100uL de estradiol (1 µg/mL) como patrón interno. X-AGM libre y estradiol se extrajo a fondo con una mezcla de AcOEt / Isopropyl alcohol 4/1 (10s x 3). La capa orgánica superior se recuperó cuidadosamente y se secó a través de flujo de N2. El residuo seco se disolvió en 100 μL de grado HPLC ACN. En paralelo para construir una curva estándar, los mismos puntos utilizados para la determinación de la carga de fármaco total se utilizaron para hacer la curva HPLC estándar. 100 μL de cada punto se añadió a una mezcla de 100 μL de bicarbonato, 100μL de estradiol y 700 μL de agua MilliQ y después se extrajo con AcOEt / alcohol isopropílico (4/1) como se ha descrito antes. La cantidad de fármaco libre se determinó por HPLC usando el mismo método descrito para la carga de fármaco no directa. El tiempo de retención fue de 2 para GG-AGM, 6 min para G-AGM, 5 min para AGM y 12 min para el estradiol. 2.2.b. Determinación de Dox total y libre por HPLC. Para determinar la carga de fármaco total de PGA-Y-Dox conjugado, 100 µL de una concentración conocida del polímero se añadió a una solución de ácido (1 mL de HCl 2 M). 100 µL de Dau (1 μg/mL) se utilizó como estándar interno. La solución se dejó 30 minutos a 80 ° C. Después de enfriar hasta TA, 360uL de 5M de NaOH se añadió para neutralizar el pH. Dox aglicona se extrajo con una mezcla de CHCl3/Isopropyl 4/1 (30 x 3). La capa acuosa superior se retiró cuidadosamente y la fase orgánica se secó usando flujo de N2. El residuo seco se disolvió en 100 µL de MeOH grado HPLC. En paralelo el mismo proceso se llevó a cabo con una mezcla de Y-Dox y daunorrubicina (DAU) para construir una curva estándar. Los estándares se disolvieron en 1 mL de MeOH grado HPLC para dar 100 µg/mL de solución madre de la que se preparó un intervalo de concentración (5-100 µg/mL). La cantidad de fármaco total liberado se determinó por HPLC utilizando columna RP18 (125x4 mm), con un flujo de 1mL/min y usando un gradiente de elución [A: 2-propanol/H2O 12:88 (v/v), disolvent

Characterization of triple‐negative breast cancer preclinical models provides functional evidence of metastatic progression

Triple‐negative breast cancer (TNBC), an aggressive, metastatic and recurrent breast cancer (BC) subtype, currently suffers from a lack of adequately described spontaneously metastatic preclinical models that faithfully reproduce the clinical scenario. We describe two preclinical spontaneously metastatic TNBC orthotopic murine models for the development of advanced therapeutics: an immunodeficient human MDA‐MB‐231‐Luc model and an immunocompetent mouse 4T1 model. Furthermore, we provide a broad range of multifactorial analysis for both models that could provide relevant information for the development of new therapies and diagnostic tools. Our comparisons uncovered differential growth rates, stromal arrangements and metabolic profiles in primary tumors, and the presence of cancer‐associated adipocyte infiltration in the MDA‐MB‐231‐Luc model. Histopathological studies highlighted the more rapid metastatic spread to the lungs in the 4T1 model following a lymphatic route, while we observed both homogeneous (MDA‐MB‐231‐Luc) and heterogeneous (4T1) metastatic spread to axillary lymph nodes. We encountered unique metabolomic signatures in each model, including crucial amino acids and cell membrane components. Hematological analysis demonstrated severe leukemoid and lymphoid reactions in the 4T1 model with the partial reestablishment of immune responses in the immunocompromised MDA‐MB‐231‐Luc model. Additionally, we discovered β‐immunoglobulinemia and increased basal levels of G‐CSF correlating with a metastatic switch, with G‐CSF also promoting extramedullary hematopoiesis (both models) and causing hepatosplenomegaly (4T1 model). Overall, we believe that the characterization of these preclinical models will foster the development of advanced therapeutic strategies for TNBC treatment, especially for the treatment of patients presenting both, primary tumors and metastatic spread

Anticancer activity driven by drug linker modification in a polyglutamic acid-based combination-drug conjugate

Combination nanotherapies for the treatment of breast cancer permits synergistic drug targeting of multiple pathways. However, poor carrier degradability, poor synergism of the combined drugs, low drug release regulation, and a lack of control on final macromolecule solution conformation (which drives the biological fate) limit the application of this strategy. The present study describes the development of a family of drug delivery systems composed of chemotherapeutic (doxorubicin) and endocrine therapy (aromatase inhibitor aminoglutethimide) agents conjugated to a biodegradable poly‐l‐glutamic acid backbone via various linking moieties. Data from in vitro cytotoxicity and drug release assessments and animal model validation select a conjugate family member with optimal biological performance. Exhaustive physicochemical characterization in relevant media (including the study of secondary structure, size measurements, and detailed small‐angle neutron scattering analysis) correlates biological data with the intrinsic supramolecular characteristics of the conjugate. Overall, this study demonstrates how a small flexible Gly linker can modify the spatial conformation of the entire polymer–drug conjugate, promote the synergistic release of both drugs, and significantly improve biological activity. These findings highlight the need for a deeper understanding of polymer–drug conjugates at supramolecular level to allow the design of more effective polymer–drug conjugates