Validation of housekeeping genes for qPCR in maize during water deficit stress conditions at flowering time

Plant stress studies are increasingly being based on gene expression. The analysis of gene expression requires sensitive, precise, and replicable measurements for specific mRNA sequences. Real-time RT-PCR is nowadays the most sensitive method for the detection of low abundance mRNA. A stable reference gene is mandatory to obtain reliable quantitative real-time PCR (qPCR) analysis results. Real-time RT-PCR is referred with one or several internal control genes, which should not fluctuate during treatments. In this study, we have chosen eight genes as candidates of possible reference genes for maize (Zea mays L) during water deficit stress at flowering time: a-tubulin, 3`phosphate glyceraldehyde dehydrogenase (GAPDH), 18S ribosomal subunit, protein 13S ribosomal, actin, zein, invertase, and starch synthase IIB. The eight reference genes candidates were tested on maize plants around flowering time, under three different conditions: before water deficit (BWD), under water deficit (WD) and after water deficit (AWD). Results from the three experimental conditions indicated that protein 13S ribosomal gene was the most stable among all the reference genes tested. This result suggests that protein 13S ribosomal gene can be used as internal control (housekeeping) for qPCR analysis in maize plants under water deficit stress during flowering time.Inst. de Genética "Ewald A. Favret"- IGEAFFil: Decima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Bossio, Adrian Ezequiel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Faccio, Paula Daniela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Beznec, Ailin. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Blumwald, Eduardo. University of California Davies. Department Plant Sciences; Estados UnidosFil: Lewi, Dalia Marcela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentin

State of the art of genetic engineering in potato: from the first report to its future potential

Potato (Solanum tuberosum L.) is a crop of world importance that produces tubers of high nutritional quality. It is considered one of the promising crops to overcome the challenges of poverty and hunger worldwide. However, it is exposed to different biotic and abiotic stresses that can cause significant losses in production. Thus, potato is a candidate of special relevance for improvements through conventional breeding and biotechnology. Since conventional breeding is time-consuming and challenging, genetic engineering provides the opportunity to introduce/switch-off genes of interest without altering the allelic combination that characterize successful commercial cultivars or to induce targeted sequence modifications by New Breeding Techniques. There is a variety of methods for potato improvement via genetic transformation. Most of them incorporate genes of interest into the nuclear genome; nevertheless, the development of plastid transformation protocols broadened the available approaches for potato breeding. Although all methods have their advantages and disadvantages, Agrobacterium-mediated transformation is the most used approach. Alternative methods such as particle bombardment, protoplast transfection with polyethylene glycol and microinjection are also effective. Independently of the DNA delivery approach, critical steps for a successful transformation are a rapid and efficient regeneration protocol and a selection system. Several critical factors affect the transformation efficiency: vector type, insert size, Agrobacterium strain, explant type, composition of the subculture media, selective agent, among others. Moreover, transient or stable transformation, constitutive or inducible promoters, antibiotic/herbicide resistance or marker-free strategies can be considered. Although great efforts have been made to optimize all the parameters, potato transformation protocols are highly genotype-dependent. Genome editing technologies provide promising tools in genetic engineering allowing precise modification of targeted sequences. Interestingly, transient expression of genome editing components in potato protoplasts was reported to generate edited plants without the integration of any foreign DNA, which is a valuable aspect from both a scientific and a regulatory perspective. In this review, current challenges and opportunities concerning potato genetic engineering strategies developed to date are discussed. We describe their critical parameters and constrains, and the potential application of the available tools for functional analyses or biotechnological purposes. Public concerns and safety issues are also addressed.Instituto de BiotecnologíaFil: Nahirñak, Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Nahirñak, Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Almasia, Natalia Ines. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Almasia, Natalia Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: González, Matías Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible (IPADS); ArgentinaFil: González, Matías Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible (IPADS); ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible (IPADS); ArgentinaFil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Feingold, Sergio Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible (IPADS); ArgentinaFil: Feingold, Sergio Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Hopp, Horacio Esteban. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Hopp, Horacio Esteban. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Hopp, Horacio Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Vazquez Rovere, Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Vazquez Rovere, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Reduced enzymatic browning in potato tubers by specific editing of a Polyphenol oxidase gene via Ribonucleoprotein complexes delivery of the CRISPR/Cas9 System.

Polyphenol Oxidases (PPOs) catalyze the conversion of phenolic substrates to quinones, leading to the formation of dark-colored precipitates in fruits and vegetables. This process, known as enzymatic browning, is the cause of undesirable changes in organoleptic properties and the loss of nutritional quality in plant-derived products. In potato (Solanum tubersoum L.), PPOs are encoded by a multi-gene family with different expression patterns. Here, we have studied the application of the CRISPR/Cas9 system to induce mutations in the StPPO2 gene in the tetraploid cultivar Desiree. We hypothesized that the specific editing of this target gene would result in a lower PPO activity in the tuber with the consequent reduction of the enzymatic browning. Ribonucleoprotein complexes (RNPs), formed by two sgRNAs and Cas9 nuclease, were transfected to potato protoplasts. Up to 68% of regenerated plants contained mutations in at least one allele of the target gene, while 24% of edited lines carried mutations in all four alleles. No off-target mutations were identified in other analyzed StPPO genes. Mutations induced in the four alleles of StPPO2 gene, led to lines with a reduction of up to 69% in tuber PPO activity and a reduction of 73% in enzymatic browning, compared to the control. Our results demonstrate that the CRISPR/Cas9 system can be applied to develop potato varieties with reduced enzymatic browning in tubers, by the specific editing of a single member of the StPPO gene family.EEA BalcarceFil: González, Matías Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agraria; Argentina.Fil: Andersson, Mariette. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Turesson, Helle. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Olsson, Niklas. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Fält, Ann-Sofie. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Storani, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET); Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Decima Oneto, Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; ArgentinaFil: Hofvander, Per. Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Plant Breeding; SueciaFil: Feingold, Sergio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina

Comparative analysis of CRISPR/Cas9 delivery approaches for polyphenol oxidase 2 gene editing in potato

PosterStPPO2 gene editing was analyzed by Agrobacterium mediated transformation with CR-PPO vector, ribonucleoprotein complexes (RNP-PPO) transfection to protoplasts, and CR-PPO transient expression in protoplasts, yielding efficiencies of 9.6%, 18.4%, and 31.9%, respectively. Transient expression of CR-PPO in protoplasts resulted in tetra-allelic edited lines, observed in 46% of total edited lines. On-target DNA insertions were found in lines from all three approaches. Loss of function of the StPPO2 protein was confirmed in a tetra-allelic edited line.EEA BalcarceFil: González, Matías Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Massa, Gabriela Alejandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía; Argentina.Fil: Anderson, Mariette. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía; Argentina.Fil: Turesson, Helle. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Storani, Leonardo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina.Fil: Olsson, Niklas. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Fält , Ann Sofie. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Hofvander, Per. Swedish University of Agricultural Sciences. Department of Plant Breeding; Suecia.Fil: Feingold, Sergio Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina

Obtención de plantas de papa sobrexpresantes de la aspartil proteasa StAP3 para incrementar la tolerancia a sequía

Una de las consecuencias del cambio climático es el estrés generado por la disminución de disponibilidad de agua (Leakey et al., 2009). La planta de papa, que representa una de las fuentes alimenticias más importantes para el hombre, es un cultivo que es altamente afectado por este tipo de estrés. Debido a estas pérdidas, resulta necesario dirigir mayor esfuerzo hacia la comprensión de los mecanismos de defensa desarrollados por la planta frente a condiciones de estrés por sequía. Las aspartil proteasas (AP) son enzimas proteolíticas que se encuentran en todos los seres vivos, y específicamente en las plantas poseen una activa participación en las respuesta adaptativa frente a condiciones de estrés. Entre estas funciones muy diversas, se ha reportado que la expresión de las mismas confieren tolerancia al estrés hídrico (Yao et. al., 2012, D´Ippolito et. al., 2020)Fil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: D`Ippólito, S. Universidad Nacional de Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Rey, María Florencia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Norero, Natalia Sigrid. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Feingold, Sergio Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Guevara, Gabriela. Universidad Nacional de Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Identificación y caracterización de Aspartil proteasas en Solanum tuberosum relacionadas a diferentes tipos de estrés

En este trabajo, realizamos un análisis del genoma de S. tuberosum para explorar las funciones potenciales de las Aspartil proteasas (AP, EC 3.4.23). Las APs son enzimas proteolíticas con funciones muy diversas que se encuentran en todos los seres vivos (1). Muchas de estas enzimas se encuentran involucradas en la respuesta de defensa de las plantas frente a diferentes situaciones de estrés. En los últimos años con la disponibilidad de genomas completamente secuenciados y herramientas bioinformáticas se ha hecho posible su identificación y estudio a gran escala.EEA BalcarceFil: Norero, Natalia Sigrid. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Rey Burusco, MF. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: D`Ippólito S. Universidad Nacional de Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.Fil: Castellote, Martín Alfredo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: Feingold, Sergio Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible; ArgentinaFil: Guevara, Gabriela. Universidad Nacional de Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Stress-induced expression of IPT gene in transgenic wheat reduces grain yield penalty under drought

Background: The heterologous expression of isopentenyl transferase (IPT) under the transcriptional control of the senescence-associated receptor-like kinase (SARK) promoter delayed cellular senescence and, through it, increased drought tolerance in plants. To evaluate the effect of pSARK::IPT expression in bread wheat, six independent transgenic events were obtained through the biolistic method and evaluated transgene expression, phenology, grain yield and physiological biomass components in plants grown under both drought and well-irrigating conditions. Experiments were performed at different levels: (i) pots and (ii) microplots inside a biosafety greenhouse, as well as under (iii) field conditions. Results: Two transgenic events, called TR1 and TR4, outperformed the wild-type control under drought conditions. Transgenic plants showed higher yield under both greenhouse and field conditions, which was positively correlated to grain number (given by more spikes and grains per spike) than wild type. Interestingly, this yield advantage of the transgenic events was observed under both drought and well-watered conditions. Conclusions: The results obtained allow us to conclude that the SARK promoter-regulated expression of the IPT gene in bread wheat not only reduced the yield penalty produced by water stress but also led to improved productivity under well-watered conditions.EEA PergaminoFil: Beznec, Ailin. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Faccio, Paula Daniela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Miralles, Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Cátedra de Cerealicultura; ArgentinaFil: Miralles, Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Instituto de Investigaciones Fisiológicas y Ecológicas Vinculadas a la Agricultura (IFEVA); ArgentinaFil: Abeledo, Leonor G. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Cátedra de Cerealicultura; ArgentinaFil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Laboratorio de Agrobiotecnología; ArgentinaFil: Décima Oneto, Cecilia Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Garibotto, María De Belén. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Garibotto, María De Belén. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Gonzalez, Germán Andrés. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Bordenave; ArgentinaFil: Moreyra, Federico. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Bordenave; ArgentinaFil: Elizondo, Matias. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria San Juan; ArgentinaFil: Elizondo, Matias. Universidad Nacional de San Juan. Facultad de Ingeniería. Departamento de Agronomía. Unidad Integrada INTA-UNSJ; ArgentinaFil: Ruiz, Mónica Beatriz. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria San Juan; ArgentinaFil: Ruiz, Mónica Beatriz. Universidad Nacional de San Juan. Facultad de Ingeniería. Departamento de Agronomía. Unidad Integrada INTA-UNSJ; ArgentinaFil: Lewi, Dalia Marcela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Blumwald, Eduardo. University of California. Department of Plant Sciences; Estados UnidosFil: Llorente, Berta. Universidad Nacional de Luján. Departamento de Ciencias Básicas; ArgentinaFil: Diaz Paleo, Antonio Horacio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Pergamino. Sección Laboratorio Biotecnología; ArgentinaFil: Bossio, Adrian Ezequiel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentin