Synthese und Funktionalisierung von weichen Hydrogelsonden auf Basis von Poly(ethylenglykol) als Kohlenhydrat Biosensoren

Cells interact with their environment via their surface. Therefore, cell surfaces play a crucial role in cellular processes such as signaling, communication, viral infections and adhesion. Every process on the cell surface relies on molecular forces that are a complex interplay of chemical, biological and physical interactions. Those interfacial interactions are mediated by ligands and receptors and are the basis of the commonly known ‘lock and key principle’ that controls cellular behavior. However, the exact mechanisms of such binding interactions at interfaces are not fully understood yet. This is especially true for ligand-receptor interactions at soft surfaces that are based on sugar ligand and protein receptor recognition. Sugar ligands are abundant on every cell as part of the glycocalyx and take part in cell- cell interactions such as tissue growth or viral infections although sugar ligands have only low affinities towards receptors. Nature overcomes this problem by using multivalency – the presentation of multiple low affinity sugar ligands e.g. anchored to a cell membrane that then leads to a stronger, since multivalent binding event. Understanding the interactions of sugar ligand modified surfaces is not only relevant in biology and medicine but can also help to use sugar ligand modification in material sciences to create e.g. novel tissue scaffolds or antiviral coatings. Therefore, it is the broad aim of this thesis to construct a robust experimental platform to precisely measure surface interactions focusing on carbohydrate mediated interactions and to elucidate the structural and physiochemical parameters that affect those interactions at interfaces. As main parameter the adhesion between a presenting carbohydrate ligand surface and protein receptors surface is determined. There are several methods, like atomic force microscopy (AFM) or surface plasmon resonance (SPR) that are suitable to quantify adhesion. However, they require a high level of technical knowledge, rather expensive equipment and most importantly do not allow for the straightforward variation of the physicochemical properties of the investigated surfaces e.g. a controlled change in mechanical properties. Therefore this work uses a novel approach via soft, hydrogel based probes to detect carbohydrate interactions. In the first part, the synthesis of soft colloidal probes suitable for adhesion measurements will be presented. These soft colloidal probes are based on a biocompatible PEG scaffolds in order to reduce non-specific interactions and allow for surface functionalization. A surfactant free synthesis of PEG microparticles using kosmotropic electrolytes to salt out PEG in an aqueous solution was performed. In order to use the hydrogel probes for the analysis of interfacial interactions, in the second part radical surface chemistry was introduced by using benzophenone as the photoinitiator to graft polymerizable monomers to the SCPs. With this highly versatile method, various functionalities such as carboxy or amine groups can be directly introduced into the PEG network. The obtained SCPs were further modified with more complex structures such as sugars or peptides and then tested for their use as SCPs in adhesion measurements. In the third part, the differently functionalized SCPs were used to measure adhesion forces by Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM). RICM is a simple method based on contact mechanics theory (JKR theory) which correlates the adhesion induced elastic deformation of the SCPs directly to their surface energy. Special focus was devoted to the measurement of sugar/lectin mediated adhesion. As a model system; the well known interaction between mannose and ConA was evaluated. Here the influence of the elasticity of the SCP, the surface bound ligand concentration and the type of grafting chemistry, was evaluated in terms of changes in the adhesion process. Then, the inhibition of the previously characterized direct binding of mannose/ConA with different monosaccharides was evaluated. Therefore, a new inhibition/competition assay based on the adhesion induced elastic deformation of the SCPs was developed. This method allowed for inhibition measurements and give fast and straightforward access to relative affinities of a variety of sugar ligands. In addition, more complex molecules like multivalent glycooligomers were used as inhibitors and screened for their relative affinities, thereby analyzing the role of multivalent ligands and their surface interactions. Finally, the combination of RICM with AFM is presented as a new technique to measure first adhesion forces between receptor-modified surfaces and the SCPs under variation of loading rate, loading forces as well as the contact time. In the same time the contact area of the adhering object can be detected. The use of such ligand modified hydrogels as force probes is supposed to mimic the physiological situation, where the soft hydrogel-like glycocalyx interacts with cell receptors. Secondly it allowed studying the ability of multivalent carbohydrates to remain bound to the receptor surface upon forced contact and competition with a ligand presenting SCP. Different ligands such as mannose or multivalent glycooligomers were used as inhibitors and screened for their inhibitory potential. In general, a new method based on PEG SCPs was developed that is suitable for the measurement of adhesion with high sensitivity allowing the detection of very weak biological interactions. On the one hand, physiochemical influences can be studied by measuring direct binding between ligands on the probes and receptors on a surface. On the other hand, stepwise inhibition of these interactions with an analyte permits the performance of an inhibition/competition assay. Thus, IC50 values suitable for determining relative affinities of molecules towards their binding to the corresponding receptors can be evaluated. Based on those adhesion measurement techniques, kinetics can be measured by combining them with AFM. Therefore, more sensitive measurements are achieved which additionally allow the measurement of forces between these two bodies. Future work will focus on expanding the techniques to further ligand/receptor pairs and to develop for high throughput screenings as a new method to determine ligand affinities. Moreover, the application of the hydrogel probes as extracellular matrix model will be tested for direct cell interaction studies via AFM.Durch die spezifische Wechselwirkungen an der Zelloberflächen werden viele biologischer Funktionen gesteuert. Beispielhaft hierfür ist die Signaltransduktion, die Adhäsion zweier Zellen oder das Anhaften eines Virus an die Zelloberfläche. Diesen Prozessen liegt die Bindung von Liganden und Rezeptoren an der Zelloberfläche zugrunde. Die strukturelle Komplexität der Bindungspartner und ermöglicht eine sehr selektive Ausbildung von Bindungen und die Steuerung einer erstaunlichen Vielzahl von Prozessen nach dem sogenannten Schlüssel Schloss Prinzip. Die Mechanismen solcher Bindungswechselwirkungen an Oberflächen und die physikalisch-chemischen Einflüsse der Membran sind dabei nicht vollständig bekannt. Dies gilt insbesondere für die Ligand/Rezeptor-Wechselwirkungen auf weichen, flexiblen Oberflächen wie der Zellmembran oder der Glykokalyx. Die Zell-Glykokalyx ist eine Kohlenhydrat-reiche Schicht, die jede eukaryotische Zelle umschließt. Die spezifischen Wechselwirkungen zwischen den Zuckerliganden der Glykokalyx und Proteinrezeptoren sind ein wichtiger Teil der Erkennungsprozesse von Zellen. Dies ist insofern erstaunlich, da Zuckerliganden nur eine geringe Bindungsaffinität zu ihren Rezeptoren zeigen. Die Natur löst das Problem der geringen Affinität durch Multivalenz – dabei werden mehrere Zuckerliganden mit ihrer geringen Affinität präsentiert, z.B. verankert an einer Zellmembran, die dann zu einem stärkeren, da mehrwertigen, Bindungsereignis führt. Das Verständnis von der Wechselwirkung von Zuckerligand modifizierten Oberflächen ist nicht nur in der Biologie und Medizin relevant, sondern wird auch in den Materialwissenschaften angewendet, um z.B. Gewebegerüste oder antivirale Beschichtungen herzustellen. Deshalb ist es das Ziel dieser Arbeit eine robuste Plattform für die Quantifizierung von schwachen Wechselwirkungen zwischen weichen Oberflächen zu schaffen, um insbesondere zuckergesteuerte Wechselwirkungen zu analysieren zu können. Dabei sollen die strukturellen und physikalisch chemischen Parameter aufgeklärt werden, die diese Wechselwirkungen beeinflussen können, z.B. die Weichheit der Oberfläche oder Dichte der Zuckerliganden. Der zentrale Messparameter bei dem entwickelten Prinzip, ist die Adhäsion, die zwischen einer Zucker- und Rezeptoroberfläche wirkt. Es gibt mehrere Verfahren, wie die Rasterkraftmikroskopie (AFM) oder Oberflächenplasmonresonanz (SPR), die geeignet sind, um spezifische zwischen Biomolekülen Adhäsion zu quantifizieren. Allerdings erfordern sie ein hohes Maß an technischem Wissen, teuren Ausrüstungen. Zudem erlauben sie nicht die einfache Variation von physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Objekte z.B. eine gezielte Änderung der mechanischen Eigenschaften der bindenden Oberflächen. In dieser Arbeit wird eine neue Methode präsentiert, welche weiche Hydrogelsonden (SCPs, soft colloidal probes) für die Adhäsionsmessungen verwendet. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Synthese dieser weichen Hydrogelsonden beschrieben. Dabei wird Poly(ethylenglykol) (PEG) als Hydrogelmaterial verwendet, da es unspezifische Wechselwirkungen reduziert und somit die Spezifität der Adhäsionsmessung erhöht. Die Synthese der Sonden erfolgt durch das Ausfällen von PEG aus einer kosmotropen Salzlösung. Um die Hydrogelsonden für Adhäsionsmessungen nutzen zu können, wird im zweiten Abschnitt die PEG Oberfläche mittels radikalischer Oberflächenchemie durch Verwendung von Benzophenon funktionalisiert. Dabei entstehen Radikale am PEG Gerüst, die das Graften von polymerisierbaren Molekülen ans PEG ermöglichen. Mit dieser Methode lassen sich eine Vielzahl an funktionellen Gruppen wie Carboxyl- oder Amingruppen an die PEG Sonden addieren. Diese funktionellen Gruppen können dann genutzt werden um komplexere Moleküle wie Zucker oder Peptide an die Sonden zu binden. Im dritten Teil der Arbeit werden Adhäsionsmessungen der funktionalisierten Sonden auf Oberflächen mittels Reflektionsinterferometrie (RICM) gemessen. RICM ist eine optische Methode um Kontaktflächen der adhärierenden Hydrogensonden sichtbar zu machen. Mit Hilfe der Kontaktmechanik (JKR Theorie) kann aus der elastischen Deformation der Sonden die Adhäsionsenergie bestimmt werden. Ein besonderes Augenmerk liegt auf der Messung von Ligand/Rezeptor Wechselwirkung von Zucker/Proteinen an Oberflächen. Um die Anwendbarkeit der neuen Methode zu zeigen, wurde das bekannte Zucker/Lektin-Paar Mannose und Concanavalin A (ConA) gewählt. Die Einflüsse von der Elastizität der Sonden, der Ligandenkonzentration sowie der Art der Funktionalisierung auf die Adhäsion wurde evaluiert. Anschließend wurde die Inhibierung der zuvor charakterisierten direkten Bindung von Mannose/ConA durch verschiedene Monozucker getestet. Daher wurde eine neue Inhibitionsmessung, basierend auf der spezifischen Adhäsion des SCPs entwickelt. Dieses Verfahren zur Inhibitionsmessung erlaubt schnellen und einfachen Zugang zur relativen Affinitäten einer Reihe von Zuckerliganden. Desweiteren wurden auch komplexere Strukturen, die sogenannten sequenzdefinierten Glykooligomere auf ihre inhibierende Wirkung getestet. Im letzten Teil der Arbeit wird die Kombination von RICM mit AFM als neue Technik vorgestellt, um Adhäsionskräfte zwischen rezeptormodifizierten Oberflächen und den SCPs unter Variation der Beladungsrate, Krafteinwirkung als auch der Kontaktzeit zu messen. Die Verwendung von ligandmodifizierten Hydrogelen als Kraftsensor soll die physiologische Situation der weichen Glykokalyx und ihrer Wechselwirkung mit Zellrezeptoren nachahmen. Zudem erlaubt es die Untersuchung der Fähigkeit mehrwertiger Zucker unter Kontakt und unter Konkurrenz mit einem ligandpräsentierenden SCP an den Rezeptoren zu binden und die Adhäsion der SCP zu unterbinden. Verschiedene Liganden, wie Mannose oder mehrwertige Glykooligomere wurden als Inhibitoren verwendet und auf ihre inhibitorische Wirkung getestet. Generell wurden neue Methoden entwickelt, die mit Hilfe von funktionalisierten PEG SCPs Messungen von Adhäsion mit hoher Empfindlichkeit erlauben und schwache biologische Wechselwirkungen nachzuweisen. Einerseits konnten physikalisch chemische Einflüsse durch direkte Bindungsstudien zwischen Liganden und Rezeptoren an einer Oberfläche getestet werden, andererseits konnte durch eine schrittweise Hemmung der Wechselwirkung durch einen Analyten die Durchführung einer Inhibitionsmessung ermöglicht werden. Dies ermöglichte die Etablierung eines screening assays, welcher relative Affinitäten der Analyten entsprechend ihrer Bindung an die Rezeptoren liefert. Basierend auf den SCP Adhäsionsmessung wurde die Kinetik durch die Kombination mit AFM gemessen. Dadurch konnten empfindliche Messungen erreicht werden, die zusätzlich Kraftmessungen zwischen einer weichen und harten Oberfläche erlauben. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die Erweiterung der Techniken konzentrieren und weitere Ligand/Rezeptor Paare testen, sowie auf die Entwicklung von High Throughput Screenings. Darüber hinaus wird die Anwendung der Hydrogel SCPs als Zellmimetik für direkte Zell Wechselwirkungsstudien mittels AFM untersucht werden

Specific Adhesion of Carbohydrate Hydrogel Particles in Competition with Multivalent Inhibitors Evaluated by AFM

Synthetic glycooligomers have emerged as valuable analogues for multivalent glycan structures in nature. These multivalent carbohydrates bind to specific receptors and play a key role in biological processes. In this work, we investigate the specific interaction between mannose ligand presenting soft colloidal probes (SCPs) attached to an atomic force microscope (AFM) cantilever and a Concanavalin A (ConA) receptor surface in the presence of competing glycooligomer ligands. We studied the SCP–ConA adhesion energy via the JKR approach and AFM pull-off experiments in combination with optical microscopy allowing for simultaneous determination of the contact area between SCP and ConA surface. We varied the contact time, loading rate and loading force and measured the resulting mannose/ConA interaction. The average adhesion energy per mannose ligand on the probe was 5 kJ/mol, suggesting that a fraction of mannose ligands presented on the SCP bound to the receptor surface. Adhesion measurements via competitive binding of the SCP in the presence of multivalent glycooligomer ligands did not indicate an influence of their multivalency on the glycooligomer displacement from the ConA surface. The absence of this “multivalency effect” indicates that glycooligomers and ConA do not associate via chelate complexes and shows that steric shielding by the glycooligomers does not slow their displacement upon competitive binding of a ligand presenting surface. These results highlight the high reversibility of carbohydrate–surface interactions, which could be an essential feature of recognition processes on the cell surface

Metal-Mediated Molecular Self-Healing in Histidine-Rich Mussel Peptides

Mussels withstand high-energy wave impacts in rocky seashore habitats by fastening tightly to surfaces with tough and self-healing proteinaceous fibers called byssal threads. Thread mechanical behavior is believed to arise from reversibly breakable metal coordination cross-links embedded in histidine-rich protein domains (HRDs) in the principle load-bearing proteins comprising the fibrous thread core. In order to investigate HRD behavior at the molecular level, we have synthesized a histidine-rich peptide derived from mussel proteins (His₅-bys) and studied its reversible adhesive self-interaction in the presence and absence of metal ions using PEG-based soft-colloidal probes (SCPs). Adhesion energies of greater than 0.3 mJ/m² were measured in the presence of metal ions, and the stiffness of the modified SCPs exhibited a 3-fold increase, whereas no adhesion was observed in the absence of metals. Raman spectroscopy confirmed the presence of metal-coordination via histidine residues by the peptide–supporting the role of His-metal complexes in the mechanical behavior of the byssus

Carbohydrate-Lectin Recognition of Sequence-Defined Heteromultivalent Glycooligomers

Multivalency as a key principle in nature has been successfully adopted for the design and synthesis of artificial glycoligands by attaching multiple copies of monosaccharides to a synthetic scaffold. Besides their potential in various applied areas, e.g. as antiviral drugs, for the vaccine development and as novel biosensors, such glycomimetics also allow for a deeper understanding of the fundamental aspects of multivalent binding of both artificial and natural ligands. However, most glycomimetics so far neglect the purposeful arranged heterogeneity of their natural counterparts, thus limiting more detailed insights into the design and synthesis of novel glycomimetics. Therefore, this work presents the synthesis of monodisperse glycooligomers carrying different sugar ligands at well-defined positions along the backbone using for the first time sequential click chemistry and stepwise assembly of functional building blocks on solid support. This approach allows for straightforward access to sequence-defined, multivalent glycooligomers with full control over number, spacing, position, and type of sugar ligand. We demonstrate the synthesis of a set of heteromultivalent oligomers presenting mannose, galactose, and glucose residues. All heteromultivalent structures show surprisingly high affinities toward Concanavalin A lectin receptor in comparison to their homomultivalent analogues presenting the same number of binding ligands. Detailed studies of the ligand/receptor interaction using STD-NMR and 2fFCS indeed indicate a change in binding mechanism for trivalent glycooligomers presenting mannose or combinations of mannose and galactose residues. We find that galactose residues do not participate in the binding to the receptor, but they promote steric shielding of the heteromultivalent glycoligands and thus result in an overall increase in affinity. Furthermore, the introduction of nonbinding ligands seems to suppress receptor clustering of multivalent ligands. Overall these results support the importance of heteromultivalency specifically for the design of novel glycoligands and help to promote a fundamental understanding of multivalent binding modes