Plasmatic membrane: cryopreservation and capacitation of equine sperm

Esta tese compreende quatro capítulos. Todos os estudos aqui relatados foram executados na Colorado State University (CSU), em Fort Collins-CO/USA. Foram utilizados sêmen de seis garanhões com idade entre 15 e 21 anos, das raças Puro-Sangue Inglês, Quarto de Milha e Árabe; estabulados no Laboratório de Reprodução Equina da CSU. Capítulo 1: dividido em três experimentos. Experimento 1: objetivou-se avaliar efeito do tratamento com 2 mg de ciclodextrina carregada com colesterol e estigmastanol (CCC , CCE); 1, 2 e 3 mg de ciclodextrina carregada com óleo de salmão (S1, S2 e S3) e com óleo de semente de linho (L1, L2 e L3) nas motilidades total (MT) e progressiva (MP) dos espermatozóides após descongelamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos (p>0,05). Experimento 2: objetivou-se avaliar MT e MP do sêmen tratado com diferentes fontes de lipídeos sonicados em meio Whitten’s Modificado (MW), após congelamento convencional e congelamento precedido por choque pelo frio; e avaliar efeito do tratamento com 2 mg de CCC e CCE sobre motilidades após choque pelo frio. Os tratamentos usando lipídeos foram: 3 e 6 mg de óleo de salmão (S3 e S6), de óleo de semente de linho (L3 e L6), de gema de ovo de galinha (G3 e G6), de óleo fígado de bacalhau (B3 e B6) e de óleo de açafrão (A3 e A6). Nenhum dos tratamentos utilizando lipídeos melhorou motilidade após congelamento convencional (p>0,05). Para o sêmen submetido a 0 oC por 30 minutos, os tratamentos G6, CCC e CCE melhoraram MT e MP (p0,05). Capítulo 2: objetivou-se mensurar quantidade de colesterol e estabelecer a relação colesterol:fosfolipídeos na membrana plasmática de células espermáticas tratadas com diferentes quantidades de CCC (0, 2, 4, 6 e 8 mg). Foram utilizados kit comercial (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) para mensuração do colesterol e ensaio de ferrotiocianato de amônio para mensuração dos fosfolipídeos totais. A quantidade de colesterol encontrada nas células tratadas com 0, 2, 4, 6 e 8 mg de CCC foram respectivamente 0,22; 0,58; 0,77; 0,91 e 1,07 μg/10 6 de espermatozóides, e a relação colesterol:fosfolipídeos para os mesmos tratamentos foram 0,39; 0,72; 1,0; 1,16 e 1,36. A quantidade de colesterol na membrana foi maior a partir do uso de 2 mg de CCC (p0,05). O estudo revelou efluxo de sódio das células espermáticas equinas viáveis após 15 minutos de incubação, sendo que nos tempos 15 e 30 minutos o percentual de celulas positivas para CG foram menores para tratamento com plasma seminal (8,8 e 4,8%) e maiores para tratamento com PC-12 (36 e 15,4%), em relação ao controle (23,6 e 11,8%, p0,05). O meio MW utilizado foi capaz de induzir efluxo de sódio e influxo de cálcio, alterações que caracterizam capacitação espermática. Capítulo 4: os objetivos aqui foram avaliar eficiência de diluidores a base de gema de ovo (Lactose-EDTA) ou gema de ovo associada a leite em pó (FR5 modificado – FR5M) e eficiência do glicerol (GLI) ou da combinação deste com metilformamida (MF) em manter MT e MP dos espermatozóides após congelamento usando diferentes protocolos (0: congelamento sem resfriamento; 20: resfriamento em palhetas por 20 minutos a 5 oC antes do congelamento; 120T: resfriamento do sêmen em tubos por 120 minutos a 5 oC; 120P: resfriamento do sêmen em palhetas por 120 minutos a 5 oC). O FR5M preservou melhor a MP de células espermáticas em todos os protocolos de congelamento utilizados, mostrando benefício da combinação da gema de ovo com leite em pó no diluente de congelamento (15%, 21%, 26% e 25% para 0, 20, 120T e 120P, respectivamente, vs. 9%, 14%, 19% e 17%, para lactose-EDTA, p0.05). Experiment 2: aimed to evaluate TM and PM of semen treated with different sonicated lipids into Modified Whitten’s Medium (MW), after conventional freezing and freezing preceded by cold shock, and assess the effect of treatment with 2 mg of CLC and CLS on motility after cold shock. Treatments using lipids were: 3 and 6 mg of salmon oil (S3 and S6); 3 and 6 mg of flax seed oil (F3, F6); 3 and 6 mg of egg yolk (E3 and E6); 3 and 6 mg of cod liver oil (C3 and C6), 3 and 6 mg of safflower oil (SF3 and SF6). None of the lipid treatments improved motility after conventional freezing (p>0.05). For semen subjected to 0 °C for 30 minutes, TM and PM increased in semen treated with E6, CLC and CLS (p0.05). Chapter 2: aimed to measure the amount of cholesterol and to establish the cholesterol:phospholipids ratio in plasma membrane of fresh equine sperm cells treated with different amounts of CLC (0, 2, 4, 6 and 8 mg). A commercial kit was used to measure cholesterol (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) and an ammonium ferrothiocyanate assay for total phospholipids measurement. Amount of cholesterol found for cells treated with 0, 2, 4, 6 and 8 mg CLC were, respectively, 0.22; 0.58; 0.77; 0.91 and 1.07 micrograms/10 6 sperm, and cholesterol:phospholipids ratios to the same treatments were 0.39; 0.72; 1.0; 1.16 and 1.36, respectively. Increase in cholesterol amount was observed when 2 mg of CLC was used (p0.05). The study showed sodium efflux after 15 minutes incubation, and at times 15 and 30 minutes the percentage of positive cells for GC were lower in SP treatment (8.8 and 4.8%) and higher for PC-12 (36 and 15.4%) compared to the CT (23.6 and 11.8%, p 0.05). The semen extender used was able to inducing sodium efflux and calcium influx, changes characterizing sperm capacitation. Chapter 4: the objectives were to evaluate efficiency of an egg yolk–based medium (lactose-EDTA) or egg yolk associated with powdered milk (modified FR5 - MFR5), and efficiency of glycerol (GLY) or a combination between GLY and dimethylformamide (MF) to maintain TM and PM sperm after freezing using different protocols (0: no cooling; 20: cooling straws for 20 minutes at 5 °C before freezing; 120T: cooling in tubes for 120 minutes at 5 °C; and 120P: cooling in straws for 120 minutes at 5 °C). MFR5 preserved PM in all freezing protocols, showing the benefit of the combination of egg yolk with powdered milk for freezing diluent (15%, 21%, 26% and 25% for 0, 20, 120T and 120P, respectively, vs. 9%, 14%, 19% and 17% for lactose-EDTA, p<0.05). The use of lactose-EDTA 5%GLY showed superior results for TM and PM if compared to the same medium with 3%MF + 2%GLY, indicating that glycerol is a cryoprotectant that can be used in several different freezing protocols (TM for Lactose-EDTA 5%GLY = 33%, 45%, 56% and 53% for 0, 20, 120T and 120P vs. 20% 30% 35% and 36% for LactoseEDTA 3%MF + 2%GLY, p <0.05; MP for Lactose-EDTA 5%GLY = 19% and 17% at 120T and 120P vs. 11% and 10% for Lactose-EDTA 3%MF + 2%GLY, p<0.05). The cooling before freezing can be performed either in tubes as in 0.5 mL straws for 120 minutes, without damage to total and progressive motility of thawed semen.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Effect of cholesterol incorporation in sperm plasma membrane on freezing and fertility of Pêga donkey (Equus asinus) semen

Objetivou-se com este estudo avaliar a eficácia da incorporação de colesterol, utilizando-se dois diferentes diluidores de incubação, na criopreservação do sêmen de jumentos da raça Pêga, determinada por meio de testes in vitro e avaliação da fertilidade in vivo. Foram utilizados 12 ejaculados de dois jumentos no Experimento 1 e oito ejaculados de um jumento no Experimento 2. O sêmen de cada ejaculado foi diluído em diluidor Stalp e em diluidor de centrifugação de Martin, respectivamente, nos Experimentos 1 e 2 para obtenção da concentração final de 120 x 106 de espermatozóides/mL e subsequente dividido em dois tratamentos: T1 &#8211; adição de 1 mg de ciclodextrina carregada com colesterol (CCC) para cada 1 mL de sêmen e T2 &#8211; sem adição de CCC. O resfriamento e congelamento do sêmen nos dois experimentos seguiram metodologia descrita por FÜRST et al. (2005), utilizando-se diluidor de congelamento de Martin. A qualidade seminal foi avaliada no sêmen fresco, resfriado e congelado. Foram avaliadas as seguintes características seminais: motilidade total, vigor espermático, morfologia espermática, integridade da membrana plasmática pelo teste supravital, funcionalidade da membrana plasmática pelo teste hiposmótico (HOST), e motilidade total e vigor espermático durante o teste de termorresistência (TTR) por 120 minutos. Em cada experimento foram inseminadas trinta éguas com sêmen do T1 e trinta com sêmen do T2. A inseminação artificial foi realizada depositando-se uma dose de 300 x 106 de espermatozóides móveis no ápice do corno ipsilateral à ovulação. No Experimento 1, a adição de 1 mg de CCC promoveu maior motilidade total do sêmen e maior funcionalidade da membrana espermática (p0,05) entre os tratamentos nas características seminais avaliadas. O sêmen descongelado do T1 e T2 apresentou vigor, integridade da membrana plasmática e percentual de defeitos morfológicos totais semelhantes (p>0,05) em ambos os experimentos. Não houve diferença (p>0,05) entre os tratamentos durante o período do TTR em nenhum dos dois experimentos. As taxas de gestação no Experimento 1 (T1 - 3,3% e T2 - 10,0%), e no Experimento 2 (T1 &#8211; 20,0% e T2 - 13,3%) não diferiram entre os tratamentos (p>0,05). A utilização dos meios Stalp e de centrifugação de Martin para incubação e centrifugação do sêmen asinino não resultou em taxas de gestação satisfatórias em éguas inseminadas pós-ovulação. Novos trabalhos visando melhorar a fertilidade do sêmen asinino quando se busca a incorporação de CCC são indicados.The objective of the present study was to evaluate the effectiveness of the cholesterol incorporation, using two different extenders for semen cryopreservation of Pêga donkeys. The effectiveness was determined by in vitro and in vivo tests for assessment of fertility. Twelve ejaculates from two donkeys in Experiment 1 and eight ejaculates from one donkey in Experiment 2 were collected. The semen of each ejaculate was diluted in Stalp extender and in Martin centrifugation extender, respectively, in Experiments 1 and 2 to obtain a final concentration of 120 x 106 sperm/mL and subsequently split into two treatments: T1 - adding 1 mg of cholesterol-loaded cyclodextrin (CLC) to each one mL of semen and T2 - without addition of CLC. The semen in two experiments was cooled and frozen following the methodology described by FÜRST et al. (2005), using the Martin freezing extender. The sperm quality was evaluated in fresh, cooled and thawed semen. The characteristics evaluated were: total motility, sperm vigor, sperm morphology, plasma membrane integrity by supravital test, plasma membrane functionality by hypoosmotic test (HOST) and total motility and sperm vigor during the thermo-resistance test (TTR) for 120 minutes. In each experiment, thirty mares were inseminated with semen from T1 and thirty with semen of T2. The artificial inseminations were done depositing a dose of 300 x 106 motile sperm at the apex of the horn ipsilateral to ovulation. In Experiment 1, the addition of 1 mg of CLC resulted in greater (p0.05) between treatments in the semen characteristics evaluated. The thawed semen of T1 and T2 had no difference (p>0.05) between the experiments in the sperm vigor, plasma membrane integrity and total morphological defects. There was no difference (p>0.05) between treatments during the TTR in any experiment. The pregnancy rates in Experiment 1(T1 - 3.3% and T2 &#8211; 10.0 %) and in Experiment 2 (T1 &#8211; 20.0% and T2 &#8211; 13.3%) did not differ (p>0.05) between treatments. The use of Stalp and Martin extenders for incubation and centrifugation of donkey semen has not resulted in satisfactory pregnancy rates in mares inseminated after ovulation. Further studies are needed to improve the fertility of donkey semen frozen with incorporation of CLC.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Viability and fertility of cooled equine semen diluted with skimmed milk or glycine egg yolk-based extenders

Two semen extenders were compared for their ability to maintain viability of horse semen during 24 hours of cold preservation, and for the pregnancy rate after artificial insemination. In the experiment 1, five ejaculates from three stallions were split-diluted in either a skimmed milk-based extender (Kenney extender) or a glycine egg yolk-based extender (Foote extender) and cooled at 6-8 ºC for 24 hours. Semen samples stored in Kenney extender for 24 hours had higher motility and spermatic vigor compared with those stored in Foote extender. However, samples stored in Foote extender had higher number of reactive sperm by hypoosmotic test and greater viability by epifluorescence test compared with those in Kenney extender. In the experiment 2, 17 and 23 ejaculates from two stallions were split-diluted with Kenney extender and Foote extender. The sperm concentration in each extender was adjusted to 500 million viable sperms per insemination dose. Semen was cooled to 6-8 ºC and stored for 24 hours. Seventy-four cycles of crossbred mares were inseminated with either semen diluted in Kenney extender or semen diluted in Foote extender. The pregnancy rate was higher from semen diluted in Kenney extender than that from semen in Foote extender (0.553 vs. 0.306). The Kenney extender is effective in preserving the motility, vigor and fertility of stallion semen after 24 hours of cold storage, whereas the Foote extender is not acceptable