Purificação, propriedades fisico-quimicas e estudo das atividades inseticida, fungicida e citotoxica de uma lectina presente em sementes de Koelreuteria paniculata

Orientador : Maria Ligia Rodrigues MacedoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Neste trabalho, uma lectina presente em sementes de Koelreuteria paniculata (família: Sapindaceae), conhecida como "flor-da-china", foi isolada e purificada a partir de extração em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,6), cromatografia de exclusão molecular (Sephadex G-100), cromatografia de afinidade (Sepharose-tripsina) e coluna de fase reversa C-18 Jl- ondapack (sistema HPLC). A pureza da lectina de K. paniculata (KpLec) foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, que revelou que esta lectina apresenta duas subunidades de massa molecular aparente de 22 e 44 kDa. Quando submetida ao tratamento com DTT, a lectina se encontra predominantemente em sua forma monomérica de 22 kDa. A massa molecular relativa estimada por gel filtração foi de 22 kDa. a extrato bruto de KpLec hemaglutinou todas as hemáceas humanas do sistema ABa e hemáceas de alguns animais como camundongo, rato, carneiro, boi e coelho. A atividade hemaglutinante de KPLEC mostrou ser estável a diferentes pHs e temperaturas. Dentre os carboidratos testados, a atividade hemaglutinante foi melhor inibida por N-acetil-glicosamina. a tratamento de KpLec com EDT A mostrou que esta lectina requer cátions divalentes para sua atividade hemaglutinante. A determinação da seqüência N-terminal de KpLec mostrou que ela apresenta homologia com outras lectinas de plantas, principalmente com a Urtica dióica aglutinina. A lectina não inibiu o crescimento dos fungos Fusarium oxysporum, Colletotrichum lindemuthianum e Saccharomyces cerevisiae e nem inibiu ou estimulou a agregação plaquetária. Entretanto, KpLec foi capaz de causar efeitos citotóxicos em células Vero (células de rim de macaco verde Africano) e apresentou atividade inseticida contra duas espécies de insetos, Callosobruchus maculatus (Coleoptera:Bruchidae) e Anagasta kuehniella (Lepidóptera:Pyralidae)Abstract: A lectin from Koelreuteria paniculata (Sapindaceae) seeds, commonly known as "Goldenrain tree", was isolated and purified by 0,1 M phosphate buffer, pH 7,6, gel filtration chromatography (Sephadex G-100), affinity column (trypsin-sepharose) and reverse phase column C-18 _-Bondapack (HPLC system). K. paniculata lectin's was assayed by polyacrylamide gel electrophoresis yielding two bands of 22 e 44 kDa. In reduced conditions, one main polypeptide chain of 22 kDa was obtained. A molecular weight of 22 kDa was estimated by gel filtration on Superdex G-75 column (FPLC system). The crude extract of KpLec agglutinated all human (ABO) system and animal erythrocytes from mice, rats, sheep, cow and rabbit. The hemagglutination activity of Kplec showed stability to distincts pHs and temperatures. Of the various sugars tested, the lectin was best inhibited by N-acetil glucosamine. The treatment of KpLec with EDT A shows that this lectin need metal ions for its hemagglutination activity. Determination of the lectin N-terminal sequence showed that KpLec present homology with plant lectins, mainly with Urtica dioica agglutinin. The lectin did not inhibit the growth of the fungi Fusarium oxyporum, Colletotrichum inndemuthianum and Saccaromyces cerevisiae. KpLec didn't induce nor inhibited the platelet aggregation. However, KpLec showed citotoxical effects in Vero cells and presented insecticidal activity against two insects pests, Callosobruchus maculatus and Anagasta kuehniellaMestradoBioquimicaMestre em Biologia Funcional e Molecula

Neurotoxic, myotoxic and cytotoxic action from the venom of the snake Lachesis muta muta (Bushmaster) : biochemistry and biological characterization of a PLA2 (LmTX-I) isolated from this venom

Orientador: Jose Camillo NovelloTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A subespécie Lachesis m. muta vive em florestas tropicais úmidas de difícil acesso, dificultando sua captura e/ou manutenção em cativeiro (obtenção do veneno). Uma revisão de 20 casos de acidentes ofídicos com humanos ocorridos na Costa Rica, Guiana Francesa, Brasil, Colômbia e Venezuela, confidentemente atribuídos a este gênero de serpente, descrevem sintomas locais de dor, edema, equimose, coagulopatia, sintomas semelhantes aos observados no envenenamento bothrópico. Entretanto, náusea, cólica abdominal, vômito constante, diarréia e sudorese foram sintomas exclusivos, não reportados em vítimas de outros viperídeos do Brasil. Um dos objetivos deste trabalho foi estudar os efeitos neurotóxico e miotóxico do veneno de L. m. muta em preparações neuromusculares isoladas de ave (biventer cervicis de pintainho) e mamífero (nervo frênico diafragma de camundongo). Em baixa concentração (2 mg/ml), o veneno exibiu potente neurotoxicidade, entretanto, nesta concentração, nenhum efeito miotóxico significativo foi observado em preparação biventer cervicis de pintainho, a miotoxicidade foi observada somente a concentrações superiores, a partir de 10 mg/ml. Ficou claro que o veneno possui componentes ativos farmacologicamente que atuam na junção neuromuscular e nas fibras musculares, o qual a intensidade de ação depende da concentração do veneno e do tipo da preparação neuromuscular (ave ou mamífero) usada. O veneno bruto de L. m. muta também foi estudado quanto a sua ação citotóxica. O veneno mostrou um efeito citotóxico frente à célula tubular epitelial renal (MDCK), induziu a uma diminuição da viabilidade celular, alterou significantemente a resistência elétrica transepitelial através da monocamada e induziu alterações morfológicas e nucleares. Foram purificadas duas novas toxinas (LmTX-I e LmTX-II) a partir do veneno total de L. m. muta, com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. Estas novas toxinas foram caracterizadas como isoformas de PLA2s básicas Asp49, em função das características físico-químicas evidenciadas. Frente a diferentes concentrações de substrato, LmTX-I mostrou um comportamento tipo alostérico. Na ausência de Ca2+ (1 mM) e na presença de íons divalentes como Zn2+ e Cu2+, a atividade PLA2 foi inibida. Foi utilizada preparação biventer cervicis de pintainho para estudar a atividade neurotóxica e miotóxica in vitro da PLA2 (LmTX-I). A toxina produziu um bloqueio irreversível da transmissão neuromuscular em concentrações baixas como 1 mg/ml. Entretanto, nesta concentração, nenhum efeito miotóxico significativo foi produzido pela toxina. O bloqueio neuromuscular não foi acompanhado da inibição da resposta contrátil à adição da acetilcolina (ACh), desta maneira, o bloqueio neuromuscular produzido pela LmTX-I pode ser atribuído preferencialmente por um efeito inibitório na liberação de ACh, sugerindo uma ação présináptica da toxina. Com uma maior concentração (30 mg/ml), LmTX-I afetou a resposta ao KCl (30% de inibição), uma concentração no qual foi observado alterações morfológicas significativas (15% de fibras danificadas), como células com tamanhos heterogêneos, vacuolizadas, ou células com miofibrilas compactadas. Entretanto, nenhum efeito citotóxico significativo, como alteração morfológica e nuclear, redução da viabilidade celular ou indução da liberação de lactato desidrogenase, usando célula tubular epitelial renal (MDCK) e celular muscular esquelética (mioblastos e miotubos) foi observadoAbstract: The subspecies Lachesis m. muta lives in tropical forests of hard access, hindering its capture and/or maintenance in captivity (obtaining of the venom). A review on 20 case-reports that occurred in Costa Rica, French Guiana, Brazil, Colombia and Venezuela, of bites in humans, reliably attributed to this snake genus, described the local symptoms of pain, swelling, blistering, and mild coagulopathy, and as similar to those caused by snakebites of the genus Bothrops and other Latin American pit vipers genera, however, early nausea, abdominal colic, repeated vomiting, watery diarrhea and profuse sweating were distinctive symptoms, not reported in victims of other viperids. The venom of L. m. muta was studied with relationship to the neurotoxic and myotoxic effects in neuromuscular preparations isolated from avian (chick biventer cervicis muscle) and mammalian (mouse phrenic nerve-diaphragm muscle). The venom, in low concentrations (2 mg/ml) exhibited potent neurotoxicity, however, in this concentration, no significant myotoxic effect was observed in avian preparation, the myotoxicity was only observed to high concentrations, up to 10 mg/ml. It became clear that the venom has pharmacologically active components that act on neuromuscular junction and muscle fibers, whose intensity of action will depend on the venom concentration and on the type of nerve-muscle preparation (mouse or chick). The whole venom of L. m. muta also showed a cytotoxic effect in MDCK epithelial cell. The venom induced to a decrease of the cellular viability, altered significant the transepithelial electrical resistance through the monolayer and induced morphologic and nuclear alterations. Through optimized methodologies of purification in HPLC, two new toxins were purified (LmTX-I and LmTX-II) from the venom of L. m. muta, with a high degree of purity and molecular homogeneity, without loss of the biological activity. These new toxins were characterized as basic isoforms of PLA2s Asp49, because they share several chemical and physical characteristics: molecular mass, retention time in re-purification on reverse phase HPLC, content of disulfide bonds, isoelectric point and primary structure. In the presence of different substratum concentrations, LmTX-I showed a behavior type allosteric under our experimental conditions. In the absence of Ca2+ (1 mM) and in the presence of divalent ions as Zn2+ and Cu2+, the PLA2 activity was inhibited. Avian muscle preparation was used to study in vitro neurotoxic and myotoxic activity of PLA2 (LmTX-I). The toxin produced an irreversible blockade of the neuromuscular transmission in low concentrations as 1 mg/ml. However, in this concentration, the toxin produced no significant myotoxic effect. The complete neuromuscular blockade of the twitch tension was not accompanied of the inhibition of the response to ACh, this way, the neuromuscular blockade produced by the LmTX-I can be preferentially attributed by an inhibitor effect in the ACh release, suggesting a pre-synaptic action of the toxin. With a high concentration (30 mg/ml), LmTX-I affected the response to KCl (30% of inhibition) after the neuromuscular blockade have been completed, a concentration that was observed significant morphologic alterations (15% of damaged fibers), as cells with heterogeneous sizes, vacuolated, or cells with compacted myofibrils. However, any significant cytotoxic effect, as morphologic and nuclear alteration, reduction of the cellular viability or induction of the release of lactic dehydrogenase was observed using tubular epithelial renal and murine skeletal muscle cellsDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula

Cytotoxicity of Lachesis muta muta snake (bushmaster) venom and its purified basic phospholipase A2 (LmTX-I) in cultured cells

Human envenoming by Lachesis muta muta venom, although infrequent, is rather severe, being characterized by pronounced local tissue damage and systemic dysfunctions. Studies on the pharmacological actions of L. m. muta venom are relatively scant and the direct actions of the crude venom and its purified phospholipase A2 (PLA2) have not been addressed using in vitro models. In this work, we investigated the cytotoxicity of L. m. muta venom and its purified PLA2 isoform LmTX-I in cultured Madin-Darby canine kidney (MDCK) and in a skeletal muscle (C2C12) cell lines. As revealed by neutral red dye uptake assay, the crude venom (10 or 100 mg/ml) induced a significant decrease in cell viability of MDCK cells. LmTX-I at the concentrations tested (70–270 mg/ml or 5–20 mM) displayed no cytotoxicity in both MDCK and C2C12 cell lines. Morphometric analysis of Feulgen nuclear reaction revealed a significant increase in chromatin condensation (pyknosis), apparent reduction in the number of mitotic nuclei and nuclear fragmentation of some MDCK cells after incubation with L. m. muta venom. Monolayer exposure to crude venom resulted in morphological changes as assessed by scanning electron microscopy. The staining with TRITC-labelled phalloidin showed a marked disarray of the actin stress fiber following L. m. muta venom exposure. In contrast, LmTX-I had no effect on nucleus and cell morphologies as well as on stress fiber organization. These results indicate that L. m. muta venom exerts toxic effects on cultured MDCK cells. The LmTX-I probably does not contribute per se to the direct venom cytotoxicity, these effects are mediated by metalloproteinases/disintegrins and other components of the venom.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior//CAPES/BrasilFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo//FAPESP/BrasilUCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias de la Salud::Instituto Clodomiro Picado (ICP