Produção de etanol de segunda geração por leveduras isoladas da biodiversidade brasileira : engenharia de biorreatores e estratégias de fermentação

A exploração da biodiversidade de leveduras e o aperfeiçoamento do processo fermentativo são estratégias que podem gerar avanços que permitam a viabilização industrial da produção de etanol de segunda geração. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo aprofundar o conhecimento sobre as leveduras recentemente prospectadas da biodiversidade brasileira com capacidade de fermentar a glicose e xilose em etanol, bem como, desenvolver estratégias de fermentação de hidrolisados resultantes do tratamento ácido e tratamento enzimático da mistura 1:1 de casca de aveia com casca de soja buscando aperfeiçoar a produção de etanol a partir destes substratos. Na primeira etapa deste estudo, a capacidade de fermentação dos hidrolisados da mistura de casca de aveia com casca de soja pela levedura, recentemente prospectada, Spathaspora hagerdaliae UFMG-CM-Y303 foi avaliada em fermentações em biorreator de tanque agitado e o efeito do oxigênio na conversão da glicose e xilose em etanol foi investigado. Três diferentes condições de aeração do meio de cultura foram testadas (anaerobiose, 0,5 vvm e 1 vvm). Limitações na capacidade de fermentação dos açúcares foram observadas nas culturas em anaerobiose e os parâmetros de produção de etanol se mostraram dependentes da condição de aeração aplicada e da concentração de açúcar do hidrolisado. Os rendimentos de conversão ao etanol (YEtOH/S) variaram de 0,23 até 0,40 g•g-1 e as produtividades volumétricas(QP) variaram de 0,06 até 0,22 g•(L•h)-1. Na segunda etapa do estudo, a fermentação dos hidrolisados da mistura de casca de aveia com casca de soja foi testada em agitador rotacional, biorreator de tanque agitado e biorreator de células imobilizadas utilizando uma ampla diversidade de leveduras dos gêneros Spathaspora, Scheffersomyces, Sugiymaella e Candida, além de uma linhagem de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada para fermentar glicose e xilose em etanol. Altos rendimentos de conversão ao etanol foram atingidos com a levedura Sp. passalidarum UFMG-CM-469 tanto em microaerofilia (0,42 g•g-1) quanto em anaerobiose (0,43 g•g-1), superando, até mesmo, os rendimentos de Sp. hagerdaliae UFMG-CM-Y303 mostrados na etapa anterior. Aumentos consideráveis na produtividade volumétrica foram atingidos com células de Sp. passalidarum UFMG-CM-469 imobilizadas em LentiKats® fermentando os hidrolisados suplementados com extrato de levedura cru, atingindo 0,30 g•(L•h)-1 na fermentação do hidrolisado resultante do tratamento ácido e 0,29 g•(L•h)-1 na fermentação do hidrolisado resultante do tratamento enzimático. A estabilidade das células imobilizadas em LentiKats® foi testada em fermentações sequenciais de hidrolisados e o desempenho fermentativo se manteve estável por mais de 250 horas de fermentação. Na terceira etapa do estudo, Sp. passalidarum UFMG-CM-469, a levedura que conferiu os melhores resultados ao longo deste trabalho, foi testada em fermentação com células imobilizadas em LentiKats® em biorreator fluidizado e de leito fixo em cultura contínua na taxa de diluição de 0,05 h-1. O biorreator fluidizado mostrou melhores parâmetros fermentativos (YEtOH/S e QP) operando em cultura contínua na taxa de diluição de 0,05 h-1. Aumentos na taxa de diluição do biorreator fluidizado (0,1 e 0,2 h-1) em cultivo contínuo geraram altos valores de produtividade volumétrica de etanol, atingindo 1,69 g•(L•h)-1 na fermentação do hidrolisado resultante do tratamento ácido e 2,74 g•(L•h)-1 na fermentação do hidrolisado resultante do tratamento enzimático.The exploration of yeast biodiversity and the improvement of the fermentation process are strategies that can generate advances that allow the industrial viability of second generation ethanol production. In this context, the present work aimed to deepen the knowledge of recently prospected yeasts from Brazilian biodiversity with the ability to ferment glucose and xylose into ethanol, as well as developing fermentation strategies of hydrolysates resulting from acid treatment and enzymatic treatment of the 1:1 mixture of oat hull and soybean hull, seeking to improve the production of ethanol from these substrates. In the first step of this study, the fermentation capacity of hydrolysates from the mixture of oat hull and soybean hull by the recently prospected yeast, Spathaspora hagerdaliae UFMG-CM-Y303 was evaluated in fermentations in a bioreactor stirred tank and the effect of oxygen on conversion of glucose and xylose to ethanol was investigated. Three different aeration conditions of the culture medium were tested (anaerobiosis, 0.5 vvm and 1 vvm). Limitations in the fermentation capacity of sugars were observed in anaerobic cultures and the parameters of ethanol production were shown to be dependent on the applied aeration condition and on the sugar concentration of the hydrolysates. The conversion yields to ethanol (YEtOH/S) ranged from 0.23 to 0.40 g•g-1 and the volumetric productivity (QP) ranged from 0.06 to 0.22 g•(L•h)-1 . In the second stage of the study, the fermentation of hydrolysates from the mixture of oat hull and soybean hull was tested in a rotational shaker, bioreactor stirred tank and immobilized cell bioreactor using a wide variety of yeasts from the genera Spathaspora, Scheffersomyces, Sugiymaella and Candida, in addition to a strain of Saccharomyces cerevisiae genetically modified to ferment glucose and xylose into ethanol. High yields of conversion to ethanol were achieved with the yeast Sp. passalidarum UFMG-CM-469 both in microaerophilic (0.42 g•g-1) and in anaerobiosis (0.43 g•g-1), even surpassing the yields of Sp. hagerdaliae UFMGCM- Y303 shown in the previous step. Considerable increases in volumetric productivity were achieved with cells immobilized of Sp. passalidarum UFMG-CM-469 in LentiKats® fermenting the hydrolysates supplemented with raw yeast extract, reaching 0.30 g•(L•h)-1 in the fermentation of the resulting hydrolysate of the acid treatment and 0.29 g•(L•h)-1 in the fermentation of the hydrolysate resulting from the enzymatic treatment. The stability of cells immobilized on LentiKats® was tested in sequential fermentations of hydrolysates and fermentation performance was stable for over 250 hours of contínuous fermentation. In the third stage of the study, Sp. passalidarum UFMG-CM-469, the yeast that gave the best results throughout this work, was tested in fermentation with cells immobilized in LentiKats® in a fluidized and packed-bed, in continuous culture in the dilution rate 0.05 h-1. The fluidized bioreactor showed better fermentation parameters (YEtOH/S and QP) operating in contínuous culture at a dilution rate of 0.05 h-1. Increases in the fluidized bioreactor dilution rate (0.1 and 0.2 h-1) in contínuous cultivation generated high values of volumetric ethanol productivity, reaching 1.69 g•(L•h)-1 in the fermentation of the resulting hydrolysate of the acid treatment and 2.74 g•(L•h)-1 in the fermentation of the hydrolysate resulting from the enzymatic treatment

Melhoramento de plantas aplicado : atividades no programa de melhoramento de milho da Dupont Pioneer, estação de pesquisa de Coxilha/RS

O presente trabalho tem como objetivo relatar o estágio curricular obrigatório realizado na empresa Dupont Pioneer sementes, localizada no município de Coxilha/RS, no período de 06 de janeiro a 28 de fevereiro de 2014. As atividades realizadas durante o estágio estiveram relacionadas ao acompanhamento dos avanços de geração realizados no programa de melhoramento de milho híbrido adaptado ao sul do Brasil, desenvolvido pela empresa. Além de poder aperfeiçoar os conhecimentos na área de melhoramento de plantas, foi possível vivenciar na prática as teorias aprendidas ao longo do curso de Agronomia, sobre manejo da cultura de milho

Biotechnological production of galactooligosaccharides (GOS) using porungo cheese whey

The bioconversion of porungo cheese whey into galactooligosaccharides (GOS) was investigated using immobilized β-galactosidase in batch system. Two enzymatic immobilization strategies were tested for optima pH and temperature and the best immobilization strategy was used to evaluate the GOS production in two steps. First, different lactose sources (substrates) were tested, and subsequently, different concentrations of porungo cheese whey (200 g L-1 and 400 g L-1) and temperatures (37 °C to 46 °C) were evaluated. Immobilization of β-galactosidase increased the range of operational pH (7.0-7.5) when immobilized in calciumalginate support. However, the pH range decreased when the immobilization was conducted using calcium-Concanavalin A support. Batch reactions using the calcium-alginate immobilized biocatalyst produced the highest yields of GOS (63.2%) from porungo cheese whey, compared to the control substrate of lactose solution at concentration of 50 g L-1 (41.1%). The temperature of 46 °C and 400 g L-1 of substrate shown the better condition to GOS production, with lactose conversion of 61.4%. These results suggest the possible use of porungo cheese whey as substrate in the biotechnological production of GOS

Production of polyhydroxyalkanoates by Bacillus megaterium : prospecting on rice hull and residual glycerol potential

The production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) by Bacillus megaterium using industrial residues, crude glycerol from biodiesel synthesis and rice hull hydrolysate (RHH), as low-cost carbon sources was investigated. The experiments were conducted by shaking flasks at 30 C and 180 rpm up to 72 h. The extraction of PHA was carried out using sodium hypochlorite to make its recovery more environmentally friendly by avoiding organic solvents (chloroform). The yields of PHA varied depending on the extraction method. A total of 33.3% (w w1) (mixing chloroform: sodium hypochlorite) and 52.5% (w w1) (sodium hypochlorite only) were obtained using glycerol and glucose as a carbon source, respectively. Preliminary experiments using RHH as a carbon source Indicated a yield of PHA of 11% (w w1) (chloroform). The PHA produced had thermal properties, such as transition temperature, similar to the commercial polyhydroxybutyrate (PHB)

Ethanol and xylitol production by recombinant strains of Saccharomyces cerevisiae and new species of Spathaspora from hydrolysates of oat and soybean hull

Os resíduos lignocelulósicos agroindustriais são substratos abundantes e de baixo custo para a produção de vários compostos de valor agregado como etanol e xilitol, por isso a importância de estudos para ampliar as formas de aproveitamento das pentoses e hexoses presentes nestas matérias primas. Em vista disso, o presente trabalho buscou estudar a composição e os processos de hidrólise ácida diluída e enzimática da casca de soja (Glycine max) e da casca de aveia (Avena sativa L), bem como avaliar a fisiologia e a capacidade de produção de metabólitos como etanol e xilitol por novas leveduras recombinantes e selvagens, a partir da fermentação destes hidrolisados. Na primeira etapa do estudo, testou-se diferentes concentrações de ácido sulfúrico em diferentes tempos de autoclave para o pré-tratamento e solubilização da fração de hemicelulose da mistura de casca de soja e casca de aveia, através do processo de hidrólise ácida diluída. A condição de 1 % de ácido em 40 minutos de autoclave foi escolhida para a obtenção do hidrolisado ácido para a fermentação. No sólido resultante do tratamento anterior, foram testadas duas enzimas, o extrato do fungo Penicillium echinulatum e a enzima comercial novozymes CELLUCLAST 1.5 ®, em três concentrações enzimáticas (10 FPU g-1,,15 FPU g-1, 20 FPU g-1).A enzima comercial novozymes CELLUCLAST 1.5 ®, na concentração de 15 FPU g-1 foi escolhida para a obtenção do hidrolisado enzimático pela maior liberação de açúcares no meio. Em uma segunda etapa, os hidrolisados ácido e enzimático e a mistura destes foram testados como meio de fermentação para duas linhagens recombinantes de Saccharomyces cerevisiae YRH 396 e YRH 400 que foram recombinadas por integração cromossômica dos genes da xilose redutase (XYL1), xilitol desidrogenase (XYL2) de Pichia stipitis e xiluloquinase (XKS1) de S. cerevisiae conferindo capacidade de metabolização da xilose. Nos ensaios em agitador orbital, a linhagem YRH 396 obteve parâmetros fermentativos (Yp/s e QP) superiores e teve seu metabolismo estudado em biorreator, apresentando valor de Yp/s de 0,39 gg-1 na fermentação do hidrolisado enzimático concentrado. Na fermentação do hidrolisado ácido em anaerobiose 71,2 % da xilose foi consumida com Yp/s (etanol) de 0,33 gg-1. Na fermentação do hidrolisado acido em um biorreator aerado com 1 vvm 64,3 % da xilose foi consumida com produção de 2,9 g L -1 de etanol e 8,17 g L -1 de xilitol. Em uma terceira etapa do trabalho, as novas espécies recentemente isoladas Spathaspora girioi e Spathaspora hagerdaliae foram testadas fermentando o hidrolisado ácido em anaerobiose e oxigênio limitado em agitador orbital. A fermentação pela espécie S. hagerdaliae foi escalonada em biorreator e apresentou Yp/s (etanol) de 0,32 gg-1 no cultivo em anaerobiose e Yx/x (xilitol) de 0,31 gg-1 em biorreator aerado.Agroindustrial lignocellulosic residues are abundant, low-cost substrates for the production of various value-added compounds such as ethanol and xylitol. Therefore, the importance of extensive studies to increase the uses of pentoses and hexoses present in these raw materials. In this context, the present study sought to study the composition and the processes of diluted acid and enzymatic hydrolysis of soybean hulls and oat hulls, and to evaluate the physiology and production of ethanol and xylitol by new wild and recombinant yeast strains during fermentation of these hydrolysates. In the first stage of the study, different concentrations of sulfuric acid were tested in different autoclave times for the pre-treatment and solubilization of the hemicellulose fraction of the soybean hull and oat bark mixture through the diluted acid hydrolysis process. The condition of 1% acid in 40 minutes of autoclaving was chosen to obtain the hydrolysate resulting from the acid treatment for fermentation. In the solid resulting from the previous treatment, two enzymes, an extract of the fungus Penicillium echinulatum and the commercial enzyme CELLUCLAST 1.5 ® Novozymes, were tested in three enzymatic concentrations (10 FPU g-1,,15 FPU g-1, 20 FPU g-1).The commercial enzyme Novozymes CELLUCLAST 1.5 ® in the concentration of 15 FPU g-1 was chosen to obtain the enzymatic hydrolysate. In the second part, the acid and enzymatic hydrolysates and the mixture of these were tested as a fermentation medium for two recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae YRH 396 and YRH 400 that were recombined by chromosomal integration of the genes xylose reductase (XYL1), xylitol dehydrogenase (XYL2) di Pichia stipitis and xylulokinase (XKS1) genes of S. cerevisiae conferring capacity of xylose metabolism. In the orbital shaker assays the YRH 396 strain showed better fermentation parameters (Yp/s and QP) and had its metabolism studied in a bioreactor, showing an Yp/s of 0.39 g g-1 in the fermentation of the concentrated enzymatic hydrolysate and consumption of 71.2 % of xylose in the fermentation of the acid hydrolysate under anaerobiosis, with Yp/s of 0.33 gg-1. In the fermentation of the acid hydrolysate in an aerated bioreactor with 1 vvm, 64.3% of xylose was consumed with production of 2.9 g L -1 of ethanol and 8.17 g L -1 of xylitol. In the third stage of the work, the species Spathaspora girioi and Spathaspora hagerdaliae were tested fermenting the acid hydrolysate in anaerobiosis and limited oxygen in orbital shaker. Fermentation by the Spathaspora hagerdaliae was staged in a bioreactor and presented Yp/s (ethanol) of 0.32 gg-1 under anaerobiosis and Yx/x (xylitol) of 0.31 under microaerobiosis

Production of Polyhydroxyalkanoates by Bacillus megaterium: Prospecting on Rice Hull and Residual Glycerol Potential

The production of polyhydroxyalkanoates (PHAs) by Bacillus megaterium using industrial residues, crude glycerol from biodiesel synthesis and rice hull hydrolysate (RHH), as low-cost carbon sources was investigated. The experiments were conducted by shaking flasks at 30 °C and 180 rpm up to 72 h. The extraction of PHA was carried out using sodium hypochlorite to make its recovery more environmentally friendly by avoiding organic solvents (chloroform). The yields of PHA varied depending on the extraction method. A total of 33.3% (w·w−1) (mixing chloroform: sodium hypochlorite) and 52.5% (w·w−1) (sodium hypochlorite only) were obtained using glycerol and glucose as a carbon source, respectively. Preliminary experiments using RHH as a carbon source Indicated a yield of PHA of 11% (w·w−1) (chloroform). The PHA produced had thermal properties, such as transition temperature, similar to the commercial polyhydroxybutyrate (PHB)