Controlled assembly of SNAP-PNA-fluorophore systems on DNA templates to produce fluorescence resonance energy transfer

The SNAP protein is a widely used self-labeling tag that can be used for tracking protein localization and trafficking in living systems. A model system providing controlled alignment of SNAP-tag units can provide a new way to study clustering of fusion proteins. In this work, fluorescent SNAP-PNA conjugates were controllably assembled on DNA frameworks forming dimers, trimers, and tetramers. Modification of peptide nucleic acid (PNA) with the O6-benzyl guanine (BG) group allowed the generation of site-selective covalent links between PNA and the SNAP protein. The modified BG-PNAs were labeled with fluorescent Atto dyes and subsequently chemo-selectively conjugated to SNAP protein. Efficient assembly into dimer and oligomer forms was verified via size exclusion chromatography (SEC), electrophoresis (SDS-PAGE), and fluorescence spectroscopy. DNA directed assembly of homo- and hetero-dimers of SNAP-PNA constructs induced homo- and hetero-FRET, respectively. Longer DNA scaffolds controllably aligned similar fluorescent SNAP-PNA constructs into higher oligomers exhibiting homo-FRET. The combined SEC and homo-FRET studies indicated the 1:1 and saturated assemblies of SNAP-PNA-fluorophore:DNA formed preferentially in this system. This suggested a kinetic/stoichiometric model of assembly rather than binomially distributed products. These BG-PNA-fluorophore building blocks allow facile introduction of fluorophores and/or assembly directing moieties onto any protein containing SNAP. Template directed assembly of PNA modified SNAP proteins may be used to investigate clustering behavior both with and without fluorescent labels which may find use in the study of assembly processes in cells

Perfil eletroforético de lombo suíno adicionado de proteínas não cárneas.

A legislação brasileira permite a adição intencional de proteínas não cárneas em alguns produtos cárneos; entretanto, há poucas técnicas adaptadas e próprias para controle desses ingredientes. Na presente pesquisa, empregou-se a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) para comparar amostras de carne suína (lombo), adicionadas de 1,5% de proteínas não cárneas (proteína isolada de soja e concentrado protéico de soro de leite). Mediante a padronização de dois protocolos distintos de extração (uréia 6M e Tris-HCl-SDS-mercaptoetanol) e a utilização de controles positivos e negativos, obtiveram-se perfis eletroforéticos típicos do músculo e das proteínas utilizadas. Ambas as extrações utilizadas foram adequadas para separação das proteínas do soro de leite das proteínas da carne, mas a visualização dos marcadores da soja não foi possível em razão da sobreposição de bandas.Made available in DSpace on 2011-04-09T22:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010044.pdf: 484836 bytes, checksum: eadebfd0a898fe3459b9e80d5b36f99d (MD5) Previous issue date: 2011-01-14201

Correlating mesophilic counts to the pseudo-CMP content of raw milk

RESUMO A presente comunicação objetivou avaliar a quantificação do caseínomacropeptídeo (CMP), bem como diferenciá-lo (devido à adulteração com soro) do pseudo-CMP (devido à proteólise bacteriana) em amostras de leite cru coletadas nos domicílios do sul do Brasil. Os resultados reforçam a necessidade de práticas higiênicas durante a ordenha e estocagem do leite. As amostras de leite estudadas não estavam adulteradas por adição de soro, mostrando que a análise por cromatografia de exclusão por tamanho deve ser complementada a fim de revelar a identidade do peptídeo (CMP ou pseudo-CMP). A contagem bacteriana total (TBC) também se mostrou útil como indicador da contaminação do leite por micro-organismos proteolíticos, uma vez que uma relação diretamente proporcional entre TBC e pseudo-CMP foi estabelecida