Regulation und Kinetik des Galaktosetransportes in der HXT NULL MUTANTE RE700 Saccharomyces cerevisiae

Galaktose-Gegentransportmessungen an Plasmamembranvesikeln präpariert aus mit Galaktose induzierten Zellen der Nullmutante RE700 ergaben folgende Km-Werte: 6,4, 6,5 und 5,3 mM. Damit ist zum erstenmal eindeutig der Mechanismus des ?facilitated diffusion? Transportes und die Kinetik des Galaktosetransporters Gal2 der Hefe bestimmt worden. Der Galaktosegegentransport an Plasmamembranvesikeln präpariert aus der Nullmutante RE700 nach Galaktose-Induktion zeigt im Vergleich zu dem mit Glukose ein deutlich niedrigeres Gegentransportmaximum, was bereits auf eine geringere Affinität von Galaktose zum Gal2 hinweist. Die entsprechenden Km-Werte aus sechs Versuchen des Glukose-Gegentransportes waren 3,9, 2,0, 4,0, 2,0, 2,2 und 2,3 mM. Der hieraus berechnete Mittelwert von 2,7 ± 0,4 mM entsprach damit der Hälfte des Km-Wertes aus dem Galaktosegegentransport mit 6,0 mM. Eine ebenso große Differenz der Km-Werte zwischen dem Transport von Galaktose und Glukose konnte bei initialen Aufnahmeversuchen an Zellen der Nullmutante RE700 nach Galaktose-Induktion erhoben werden. Aus 28 Einzelversuchen mit Galaktose als Transportsubstrat ergab sich ein Km-Wert von 3,7 ± 0,3 mM, der damit doppelt so hoch wie der bei der initialen Glukoseaufnahme lag mit einem Km-Wert von 1,8 ± 0,1 mM (46 Versuche). Im t-Test (?two-tailed?) erwies sich dieser Unterschied als hochsignifikant mit einem P-Wert < 0,0001. Der niedrige Km-Wert von 1,8 ± 0,1 mM bei der initialen Glukoseaufnahme bestätigt den berechneten Km-Wert aus den Gegentransport- versuchen von Maier mit 1,5 mM und liegt auch mit dem hier erhobenen Km-Wert von 2,7 ± 0,4 mM im Einklang. Der Km-Wert des initialen Galaktosetransportes beim Wildtyp 996A nach Galaktose-Induktion betrug in 8 Einzelversuchen 4,3 ± 0,7 mM und war somit nicht signifikant verschieden von dem entsprechenden Km-Wert der Nullmutante RE700 mit 3,7 ± 0,3 mM. Die niedrigen Km-Werte für Glukose mit 1,8 mM am Gal2-Transporter der Hefe sind in Übereinstimmung mit entsprechenden Km-Werten des menschlichen Glukosetransporters Glut1 aus der Literatur mit 1,6 und 2,4 mM [Stein90] [Fuhrmann89(1)]. Dagegen sind die Km-Werte für den Galaktosetransport mit 6 und 3,7 mM am Gal2 Transporter der Hefe deutlich verschieden gegenüber dem Km-Wert von 12 mM beim menschlichen Glut1 Transporter. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass der Hefetransporter Gal2 kein asymmetrisches Transportverhalten wie der menschliche Glut1 beim Erythrozyten aufweist. Damit ist nicht nur die Struktur sondern auch die Funktion beider Transporter verschieden. Durch die Anwesenheit von Glukose (?Glukoseshift?) wird eine Repression von Enzymen hervorgerufen. Beim Wildtyp 996A verschwindet der induzierte Galaktosetransporter Gal2 wieder vollständig. Der Abbau erfolgt exponentiell (Korrelationskoeffizient 0,955) mit einem K-Wert von 0,36 ± 0,06 und einer Halbwertzeit von 1,92 Stunden, sodass nach etwa 8 Stunden fast kein Galaktosetransport mehr nachzuweisen ist. Dieses Verhalten und der zeitliche Ablauf entsprechen in etwa den Angaben aus der Literatur [Galindez83] [Horak97]. Im Vergleich zu den Wildtyp-Hefezellen zeigt die Nullmutante RE700 beim ?Glukoseshift? ein signifikant anderes Verhalten, es wird nämlich nur etwa die Hälfte der induzierten Galaktosetransporter abgebaut. Dabei strebt die Abnahme der Galaktosetransporter auf ein Plateau zu. Es werden in diesen Versuchen 40 bis 53% der Galaktosetransporter nicht abgebaut und bleiben aktiv. Dabei ist die Geschwindigkeit des Teilabbaues der Galaktosetransporter schneller als beim Wildtyp 996A. Auf Grund der Streuung lässt sich jedoch hierbei keine exakte Kinetik bestimmen. Das Phänomen der Plateaubildung wurde in dieser Weise bisher noch nicht beobachtet und es ist nicht bekannt, warum die Nullmutante RE700 ihre Galaktosetransporter nicht vollständig abbaut wie Wildtypen der Hefen. Möglicherweise ist durch das Entfernen der Gene für die Glukosetransporter das empfindliche Zusammenspiel der verschiedenen Leloir-Enzyme bei der ?Downregulierung? des Gal2 in der Zelle gestört. Es ist außerdem vorstellbar, dass durch Ausfall der Glukosetransporter als Regulativ bei der Nullmutante ein noch nicht bekannter ?Selbsterhaltungstrieb? die Katabolitinaktivierung des Galaktosetransporters nach gewisser Zeit stoppt. Zur Abklärung dieses interessanten Phänomens sind weitere Versuche notwendig

Kationenpermeabilität von Erythrozyten bei niedriger Ionenstärke in Abhängigkeit bestimmter Anionen und Inhibitoren unter besonderer Berücksichtigung des Glucosetransporters

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem Kationenefflux aus Erythrozyten bei niedriger Ionenstärke. Nach einer Hypothese von Fuhrmann sollte der Kationenausstrom durch veränderte Glucosetransporter erfolgen. Vorausbedingungen für diese Veränderungen des Fluxverhaltens der Glucosetransporter ist eine Alkalisierung des Zellinneren. Im ersten Teil der Arbeit wurde darum die Effektivität des Kationenefflux in Anwesenheit verschiedener monovalenter oder divalenter Anionen untersucht. Das Ergebnis entspricht den experimentellen Erwartungen einer vergleichbaren Effektivität von Nitrat und Chlorid auf den Hydroxyl-Exchange des Anionenaustauschers Bande III. Bei beiden Anionen vermindert sich der Kationenefflux mit abnehmendem Anionen-Gradienten Innen- gegen Außenkonzentration. Sulfatbeladene Erythrozyten ließen eine geringere Effektivität erwarten, da der Hydroxyl-SO4-Exchange über den Anionenaustauscher eine geringere Austauschgeschwindigkeit als z.B. der Hydroxyl-Chlorid-Exchange besitzt. Ähnlich wie Sulfat-Ionen hemmen auch Phosphat-Anionen den Anionen-Exchange. Die Wirkung der monovalenten und divalenten Anionen auf den Kationenefflux ist im Einklang mit einer Modulation der Effektivität des Anionenaustauschers. Eine Verminderung des Anionengradienten als auch Sulfat- oder Phosphat-Ionen im System führen zu einem verminderten Hydroxyl-Anion-Exchange und dementsprechend zu einer geringeren Alkalisierung in den Erythrozyten. Komplexer gestaltet sich die Frage eines Einflusses der Pufferkapazität auf den Kaliumefflux bei niedriger Ionenstärke. In den Erythrozyten selbst ist das Polyanion Hämoglobin mit 7.3 mM der wichtigste Puffer. Der Zusatz eines Außenpuffers wie HEPES muss über den Hetero-Anionen-Exchange (Gleichgewicht zwischen Hydroxyl-, Hydrogencarbonat- und weitere vorhandene Anionen) auch die Pufferkapazität des Hämoglobins beeinflussen. Ersetzt man den impermeablen Nichtelektrolyt Sorbit durch Glucose, so ließe sich durch Interferenz der Glucose mit dem Glucosetransporter eine mögliche Beeinflussung der Kaliumpermeabilität bei niedriger Ionenstärke erwarten. Dies ist auch tatsächlich der Fall. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit Hemmstoffen, bzw. Modulatoren des Kationenefflux bei niedriger Ionenstärke. Die Substanzen wurden in diesen Experimenten erst nach 1 Minute zugesetzt zu einer Zeit als der schnelle Hydroxyl-Chlorid bzw. Hydroxyl-Nitrat-Exchange in der Zelle bereits abgelaufen war. Den stärksten Effekt bewirkte dabei DIDS, ein effektiver Inhibitor des Anionentransportes. Sowohl die Geschwindigkeitskonstanten als auch der Prozentsatz der permeablen Zellen nahmen mit zunehmender DIDS-Konzentration signifikant ab. Der außerordentlich niedrige Ki-Wert von nur 100 nM spricht für eine Hemmwirkung von DIDS am orientierten Anionentransporter [Furuya84], da der Ki-Wert bei physiologischer Ionenstärke am nichtorientierten Transporter mit 0.3 µM wesentlich höher ist. DIDS selbst hat keinen Einfluss auf den Glucosetransporter bei hoher Ionenstärke, es beeinflusst aber den Glucosetransport bei niedriger Ionenstärke und hebt einen Teil der Hemmwirkung am Glucosetransport auf. Dies Ergebnis spricht für eine indirekte Beteiligung des Anionentransporters am Kationenefflux bei niedriger Ionenstärke. Im Gegensatz zum DIDS hat das Arginin-spezifische Reagenz Phenylglyoxal eine in dieser Arbeit erstmalig nachgewiesene direkte Wirkung auf den Glucosetransport bei hoher Ionenstärke. Der Ki-Wert beträgt hierbei 6 mM. Dies Ergebnis kann mit dem Vorhandensein von Arginin an der Innenseite des Glucosetransporters in Zusammenhang gebracht werden, die den Glucosekanal durch ihre positive Ladung vor Kationen abschirmen sollen. Das Ergebnis entspricht den Versuchen mit DIDS, das wie auch Phenylglyoxal ein Inhibitor des Anionentransportes ist. SDS bewirkt eine Hemmung des Glucosetransportes bei hoher Ionenstärke. Ki-Wert liegt bei 60 µM. Der hemmende Effekt kann durch Einlagerung von negativ geladenen SDS-Molekülen erklärt werden. Die Wirkung ist ähnlich wie bei niedriger Ionenstärke, bei der im Kanal negative Ladungsträger auftreten. Auch hierbei nimmt die Affinität für Glucose und die Vmax signifikant ab. Auf den Kationenefflux bei niedriger Ionenstärke hat SDS einen stimulierenden Effekt. Sowohl die Geschwindigkeitskonstante als auch der Prozentsatz permeabler Zellen nehmen mit steigender Konzentration signifikant zu. Außerdem liegt der EC50-Wert mit 17 µM in der gleichen Größenordnung wie der Ki-Wert des Glucosetransportes. Besonders das letzte Ergebnis ist in guter Übereinstimmung mit der Theorie von Michaelis, dass Festladungen in Membrankanälen deren Permeabilität bestimmen. Die vorliegenden Ergebnisse stützen die Vorstellung, dass unter bestimmten Bedingungen die Glucosetransporter in der Erythrozytenmembran auch Kanäle für Kationen sein können

Throughput analysis of full-duplex communication cognitive radio network

In this paper we deal with the throughput of full-duplex cognitive communication radio which exploits unused band of primary user (PU) network. Classical cognitive radio uses half-duplex communication spectrum sensing to perform spectrum sensing and data transmission at different time intervals. It’s well-established fact that in half-duplex communication cognitive radio spectrum sensing time increases at low SNR which gives rise to lesser data transmission time for secondary user (SU) and hence results in less throughput for SU. It’s useful idea to do spectrum sensing and data transmission at the same time with two different antennas co-located on the SU transceiver. This shall not only guarantee high probability of detection of PU but also increased data transmission which means more throughput for SU. However, simultaneous sensing and data transmission has inherent problem of self-interference. One of the possible solution is to use polarisation discrimination in which sensing and data transmission antennas must use different polarisation. This is feasible if there is prior information about the polarisation of the signals emitted by the PUs. It shall be of special interest to assess throughput using analytical expressions for probability of detection PD, probability of false alarm PFA at various values of SNR for time-slotted cognitive radio which uses half-duplex spectrum sensing and non-time-slotted cognitive radio which uses full-duplex communication cognitive radio