Improving Protein Crystal Quality by the Without-Oil Microbatch Method: Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Analysis of Glutathione Synthetase from Pseudoalteromonas haloplanktis

Glutathione synthetases catalyze the ATP-dependent synthesis of glutathione from l-γ-glutamyl- l-cysteine and glycine. Although these enzymes have been sequenced and characterized from a variety of biological sources, their exact catalytic mechanism is not fully understood and nothing is known about their adaptation at extremophilic environments. Glutathione synthetase from the Antarctic eubacterium Pseudoalteromonas haloplanktis (PhGshB) has been expressed, purified and successfully crystallized. An overall improvement of the crystal quality has been obtained by adapting the crystal growth conditions found with vapor diffusion experiments to the without-oil microbatch method. The best crystals of PhGshB diffract to 2.34 Å resolution and belong to space group P212121, with unit-cell parameters a = 83.28 Å, b = 119.88 Å, c = 159.82 Å. Refinement of the model, obtained using phases derived from the structure of the same enzyme from Escherichia coli by molecular replacement, is in progress. The structural determination will provide the first structural characterization of a psychrophilic glutathione synthetase reported to date

Diclofenac-Induced Apoptosis in the Neuroblastoma Cell Line SH-SY5Y: Possible Involvement of the Mitochondrial Superoxide Dismutase

Diclofenac, a nonsteroidal anti-inflammatory drug, induces apoptosis on the neuroblastoma cell line SH-SY5Y through a mitochondrial dysfunction, affecting some antioxidant mechanisms. Indeed, the time- and dose-dependent increase of apoptosis is associated to an early enhancement of the reactive oxygen species (ROS). Mitochondrial superoxide dismutase (SOD2) plays a crucial role in the defence against ROS, thus protecting against several apoptotic stimuli. Diclofenac decreased the protein levels and the enzymatic activity of SOD2, without any significant impairment of the corresponding mRNA levels in the SH-SY5Y extracts. When cells were incubated with an archaeal exogenous thioredoxin, an attenuation of the diclofenac-induced apoptosis was observed, together with an increase of SOD2 protein levels. Furthermore, diclofenac impaired the mitochondrial membrane potential, leading to a release of cytochrome c. These data suggest that mitochondria are involved in the diclofenac-induced apoptosis of SH-SY5Y cells and point to a possible role of SOD2 in this process

Ligand-based chemoinformatic discovery of a novel small molecule inhibitor targeting CDC25 dual specificity phosphatases and displaying in vitro efficacy against melanoma cells

CDC25 phosphatases are important regulators of the cell cycle and represent promising targets for anticancer drug discovery. We recently identified NSC 119915 as a new quinonoid CDC25 inhibitor with potent anticancer activity. In order to discover more active analogs of NSC 119915, we performed a range of ligand-based chemoinformatic methods against the full ZINC drug-like subset and the NCI lead-like set. Nine compounds (3, 5?9, 21, 24, and 25) were identified with Ki values for CDC25A, -B and -C ranging from 0.01 to 4.4 ?M. One of these analogs, 7, showed a high antiproliferative effect on human melanoma cell lines, A2058 and SAN. Compound 7 arrested melanoma cells in G2/M, causing a reduction of the protein levels of CDC25A and, more consistently, of CDC25C. Furthermore, an intrinsic apoptotic pathway was induced, which was mediated by ROS, because it was reverted in the presence of antioxidant N-acetyl-cysteine (NAC). Finally, 7 decreased the protein levels of phosphorylated Akt and increased those of p53, thus contributing to the regulation of chemosensitivity through the control of downstream Akt pathways in melanoma cells. Taken together, our data emphasize that CDC25 could be considered as a possible oncotarget in melanoma cells and that compound 7 is a small molecule CDC25 inhibitor that merits to be further evaluated as a chemotherapeutic agent for melanoma, likely in combination with other therapeutic compounds

Analysis of SOD3 and Akt in ascending aortic aneurysm

Ascending aortic aneurysm (AsAA) is divided into three different forms: syndromic, familial non-syndromic, and degenerative. Bicuspid aortic valve (BAV), occuring in 2% of the population, is the most frequent cardiac congenital abnormality, associated to AsAA. All the different forms of AsAAs are a consequence of cystic medial necrosis (CMN), characterized by apoptotic loss of smooth muscle cells (SMCs), fragmentation of elastic and collagen fibers and increased accumulation of mucoid material. The extracellular superoxide dismutase (SOD3) is a Cu/Zn enzyme, affecting redox state and homeostasis of extracellular matrix (ECM) (1). Moreover, the outsidein signalling from ECM modulates intracellular pathways regulating many cellular functions. The multifunctional Akt pathway affects survival and cellular proliferation and has important effects on the cardiovascular function. In this study we examined the relevance of SOD3 and Akt in AsAA pathogenesis. To this aim, the SOD3 and Akt protein levels were evaluated in normal ascending aortic tissues (n=6) and in tissues from AsAAs associated both to tricuspid aortic valve (TAV) (n=6) and BAV (n=6); moreover, we measured SOD3 activity in sera from healthy donors and patients with AsAA. Our data showed a reduction of SOD3 and phospho-Akt (pAkt) protein levels in AsAAs from BAV patients compared to normal donors; on the other hand, no differences emerged in SOD3 activity. Furthermore, immunohistochemical analysis performed on normal and pathological ascending aortic tissues showed a SOD3 immunostaining in both extracellular space and tunica media cells from normal ascending aortic tissues; conversely, no SOD3 immunostaining was detected in AsAAs tissues from both TAV and BAV patients. Our data show that SOD3 and pAkt could be associated to AsAA pathogenesis and suggest a link between ECM homeostasis and Akt survival pathway

Funzione antiossidante di enzimi chiave coinvolti nella difesa dallo stress ossidativo in un procariota adattato al freddo

Pseudoalteromonas haloplanktis è un eubatterio psicrofilo isolato dal mare antartico, in grado di crescere nell’intervallo di temperatura tra 4 e 20°C. Sono già numerose le ricerche condotte su proteine isolate da P. haloplanktis. Inoltre si conosce la sequenza dell’intero suo genoma e sono state descritte alcune applicazioni biotecnologiche delle sue macromolecole. L’ambiente marino freddo in cui cresce questo eubatterio suggerisce un approfondimento sul suo adattamento alla protezione dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Infatti, la difesa dai ROS in P. haloplanktis è complicata dal fatto che le basse temperature del mare favoriscono la solubilità dell’ossigeno ed aumentano la stabilità dei ROS. D’altra parte nel genoma di P. haloplanktis mancano alcuni geni per la produzione endogena di ROS. Il primo ROS generato dal consumo di ossigeno è l’anione superossido e l’enzima chiave per la sua eliminazione, la superossido dismutasi (SOD), è presente ed altamente efficiente. La difesa dai ROS in P. haloplanktis non comprende però solo una difesa diretta, come quella della SOD, ma anche una protezione indiretta, come ad esempio quella esercitata dal sistema della tioredossina, preposto al mantenimento delle proteine cellulari nel loro stato ridotto. Inoltre gli effetti deleteri dei ROS potrebbero essere controllati anche da altri componenti del metabolismo dello zolfo, che comprendono piccole molecole, come ad esempio il glutatione. Con questo progetto s’intende studiare l’adattamento al freddo di alcuni sistemi enzimatici di P. haloplanktis, preposti alla difesa dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS). Il primo enzima oggetto di studio è la Fe–SOD da P. haloplanktis (PhSOD) che, da ricerche pregresse eseguite presso questa Unità, si era dimostrata dotata di un’elevata attività specifica anche a basse temperature. Essa inoltre è molto sensibile all’inattivazione da perossinitrito e contiene un unico residuo di cisteina (Cys57), molto reattivo nei riguardi di reagenti sulfidrilici. Con tale progetto si studierà la regolazione della funzione antiossidante della PhSOD in seguito a modificazioni covalenti su specifici residui dell’enzima. In particolare si cercherà di capire se l’inattivazione della PhSOD causata dal perossinitrito è dovuta alla nitrazione di uno secifico residuo di tirosina. Inoltre si cercherà di identificare tioli cellulari in grado di reagire con la Cys57. A tal riguardo in altri gamma–proteobatteri il più abbondante tiolo cellulare è il glutatione che forma disolfuri misti con le cisteine proteiche, regolandone in tal modo le funzioni. Il glutatione inoltre è presente nella sua forma ridotta e ossidata ed il rapporto tra queste forme regola il potenziale redox cellulare; esiste anche una forma nitrosilata, derivante dalla reazione del glutatione con ossido nitrico. Pertanto si cercherà di evidenziare se la Cys57 della PhSOD è soggetta ad una reazione di S–glutationilazione, individuando quale delle forme del glutatione causa la formazione del disolfuro misto e se la modifica covalente regola le funzioni dell’enzima. L’altro sistema enzimatico oggetto di studio in P. haloplanktis è quello della tioredossina, costituito da tioredossina (PhTrx) e tioredossina riduttasi (PhTrxR). Queste due proteine saranno ottenute in forma ricombinante ed in particolare fuse ad un peptide contenente sei istidine, utile per la purificazione dei prodotti di espressione. La loro caratterizzazione riguarderà il contenuto delle cisteine totali e di quelle libere, nonché la presenza del coenzima flavinico e l’organizzazione come omodimero della PhTrxR. Si passerà poi allo studio delle proprietà biochimiche delle due proteine, valutando anche l’attività combinata di PhTrxR e PhTrx nel sistema completo della tioredossina, comprendente NADPH come donatore di elettroni e insulina umana come susbstrato, anche al fine di determinare il potenziale di riduzione del sistema e la reversibilità della reazione redox. Si valuterà infine la termofilicità ed i parametri cinetici ed energetici di tutte le reazioni, nonché la termostabilità delle proteine mediante profili di inattivazione e denaturazione termica. L’ultimo aspetto della ricerca riguarda il ruolo del glutatione nella regolazione del potenziale redox di P. haloplanktis. Si cercherà di evidenziare la presenza di questo tripeptide in cellule di P. haloplanktis cresciute in diverse condizioni sperimentali, che includono anche stress ossidativo. Il glutatione sarà evidenziato sia in maniera diretta, sia attraverso l’identificazione di proteine glutationilate negli estratti proteici. Inoltre si valuterà se la glutationilazione riguarda, oltre alla PhSOD, anche i componenti del sistema della tioredossina. Pertanto tale progetto verificherà l’adattamento al freddo di SOD e Trx/TrxR durante il controllo dell’omeostasi redox di un microrganismo psicrofilo e se la funzione antiossidante di tali proteine è regolata dalla reattività di specifici gruppi sulfidrilici

Caratterizzazione biochimica della superossido dismutasi dell'eubatterio psicrofilo Pseudoalteromonas haloplanktis: ruolo regolatorio di un residuo di cisteina molrto reattivo

La superossido dismutasi (SOD) è un enzima ubiquitario che dismuta l’anione superossido in perossido di idrogeno e ossigeno molecolare, svolgendo un ruolo chiave nei meccanismi di difesa della cellula dai radicali tossici dell’ossigeno (ROS). La SOD purificata dall’eubatterio psicrofilo Pseudoalteromonas haloplanktis (PhSOD) è stata oggetto di caratterizzazione biochimica e funzionale, al fine di estendere le conoscenze sull’adattamento delle SOD alle basse temperature e di approfondire alcuni aspetti della regolazione funzionale di tale enzima. La PhSOD è un omodimero contenente Fe nel sito attivo e possiede un’elevata attività specifica, persino a basse temperature. La stabilità termica dell’enzima psicrofilo supera di molto la temperatura di crescita di P. haloplanktis, una caratteristica comune ad altre Fe- e Mn-SOD e che probabilmente riflette la tolleranza di tale enzima a vari tipi di stress ambientali. Tra le proprietà biochimiche dell’enzima psicrofilo quella che ha destato maggiore attenzione è stata l’elevata sensibilità al perossinitrito, un ROS che agisce da inattivatore fisiologico della Mn-SOD mitocondriale. Il bersaglio di tale ROS è la Tyr34, un residuo conservato in tutte le Fe- e Mn-SOD, situato nel canale di accesso al sito attivo dell'enzima. E’ stata determinata la struttura primaria della PhSOD, che mostra un’elevata percentuale di identità amminoacidica con la Fe-SOD di E. coli ed una significativa similarità anche con la Mn-SOD mitocondriale. Inoltre sulla PhSOD è stato identificato un unico residuo di cisteina altamente reattivo (Cys57), che forma un addotto covalente con il β-mercaptoetanolo in condizioni native e un ponte disolfuro inter-subunità in specifiche condizioni denaturanti. La modifica da parte del β-mercaptoetanolo riduce di poco l’attività dell’enzima e la sua stabilità termica, ma ha un significativo effetto sulla sensibilità al perossinitrito e sul grado di nitrazione delle tirosine, proteggendo quindi l’enzima dall’inattivazione. Proteine contenenti gruppi sulfidrilici molto reattivi sono bersaglio di modifica covalente da parte di tioli cellulari, come il glutatione, che giocano un ruolo chiave nella regolazione dello stato redox cellulare. In effetti la Cys57 forma un ponte disolfuro con il glutatione e tale modifica riduce significativamente la sensibilità dell’enzima verso il perossinitrito. E’ probabile che, in condizioni di stress ossidativo, la PhSOD sia gluationilata anche in vivo, assumendo quindi un ruolo chiave nella regolazione dello stato redox cellulare

Energetic aspects of intramolecular coupling between the nucleotide binding site and the distal switch II region of the yeast RAS2 protein

AbstractWe have studied the interaction of the yeast RAS2 protein with guanine nucleotides using energetic parameters for the dissociation of RAS·nucleotide complexes. The results indicated that a Gly → Ser substitution at position 82 led to an altered interaction with GppNHp and, to a lesser extent, also with GDP. It was also possible to conclude that structural perturbation of Gly82 can stimulate nucleotide release by decreasing the energetic barrier for nucleotide dissociation. This, together with the observation that residues 80 and 81 are involved in the response of RAS to nucleotide exchange factors without affecting GDP binding per se, suggests a potential mechanism for exchange factor-stimulated GDP release