Az interleukin-15 receptor molekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata humán sejtvonalakon = Investigation of molecular interactions of interleukin-15 receptor on human cell lines

Az IL-15 citokin fontos szerepet játszik a T sejtek működésében és homeosztázisában. Receptora felépítésében a citokin-specifikus alfa lánc és az IL-2R felépítésében is részt vevő béta és gamma alegység vesz részt. Modern biofizikai módszerekkel (FRET, CLSM, FCS, NSOM stb.) vizsgáltuk az IL-15R összeszerelődését és sejtfelszíni elrendeződését humán T sejteken. Kimutattuk, hogy a Kit225 FT7.10 humán T limfóma eredetű sejteken a magas affinitású heterotrimer IL-15R komplex előre összeszerelt állapotban van jelen. Korábban hasonló eredményt kaptunk a heterotrimer IL-2 receptorra vonatkozóan. Igazoltuk a két alfa alegység molekuláris kolokalizációját és együttes laterális diffúzióját, ami asszociációjuk stabil voltára utal (legalábbis a néhány 10 ms-os időskálán). Eredményeink alapján megalkottuk az IL-2/15R rendszer dinamikus heterotetramer modelljét: a releváns citokin kötődése a receptor alegységek átrendezésével alakítja ki a megfelelő nagy affinitású heterotrimert. Kimutattuk, hogy az IL-15Ralfa és az IL-2Ralfa nagyméretű (néhány 100 nm-es) domének mellett kisméretű, csak néhány molekulából álló klaszterekben (vagy akár egyedi molekulaként) is megtalálható a vizsgált T limfóma sejteken. Kimutattuk, hogy az IL-2/15R és az MHC molekulák közös szuperklasztereket alkotnak a T sejtek lipid tutajaiban. Ezen klasztereket mind sejtvonalakon, mind pedig klinikai mintákból származó primer T sejteken azonosítottuk. Kimutattuk, hogy a szöveti környezet módosíthatja a mintázatokat. | IL-15 plays an important role in T cell homeostasis and function. Its receptor consists of the cytokine-specific alpha chain and the beta and gamma subunits, also utilized by IL-2R. By using modern biophysical methods (FRET, CLSM, FCS, NSOM) we have studied assembly and cell surface organization of IL-15R in human T cells. It was demonstrated that similar to the heterotrimeric IL-2R, the high affinity heterotrimeric IL-15R complex is preassembled even in the absence of its ligand in Kit225 Ft7.10 cells. We have shown co-localization of the two alpha chains at the molecular level, as well as their co-mobility indicating stability of their association (at least at the time scale of several tens of milliseconds). Based on our data, we have envisaged a dynamic heterotetrameric model of the IL-2/15R system, where binding of the appropriate cytokine rearranges receptor subunits to form the appropriate high-affinity receptor trimer. In addition to large clusters (several hundreds nanometers), we have revealed that IL-15Ralpha and IL-2Ralpha may also exist in small clusters (or even as monomers) at the surface of studied T cells. We have shown that IL-2/15R and MHC glycoproteins form supramolecular clusters in lipid rafts of T cells. These motifs were identified in cell lines as well as in primer T cells derived form clinical samples. We have shown that tissue environment can rearrange these protein patterns

Sejtfelszíni és magreceptorok többszörös asszociációjának és dinamikájának vizsgálata fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia és energia transzfer segítségével = Examination of the multiple association and dynamics of cell surface and nuclear receptors by fluorescence correlation spectroscopy and energy transfer

Az interleukin-2 és -15 citokinek fontos szerepet játszanak a T sejtek funkciójának és homeosztázisának szabályozásában. A pályázat keretében az IL-2/15R komplex összeszerelődését, sejtfelszíni elrendeződését és más membránfehérjékkel kialakított kölcsönhatásait tanulmányoztuk humán T sejtek felszínén. Igazoltuk, hogy az MHC I glikoproteinek szervező szerepet játszanak az IL-2/15R klaszterek összeszerelődésében. Az IL-2/15R és az MHC I/II glikoproteinek által alkotott klaszterek stabilitása nem függ jelentős mértékben a citoszkeletontól, az asszociációk apoptotikus blebek felszínén is megmaradnak. Jellemeztük az ILRAP - egy IL-2R-rel asszociálódó fehérje molekuláris kölcsönhatásait, ami hozzájárulhat az IL-2/IL-15 eltérő hatásspektrumának magyarázatához. Közvetlen bizonyítékát adtuk az IL-15 transz prezentációjának két T limfóma sejttípus között. Kidolgoztunk egy megbízható módszert, mellyel GFP és mRFP között lehet FRET méréseket végezni. FRET, FCCS és modellezés segítségével leírtuk a Jun-Fos komplex C terminális konformációját, ami a működésre vonatkozó felvetéseket is eredményezett. RXR és RAR magreceptorok és funkcionális mutánsaik mobilitását vizsgálva megállapítottuk, hogy a magreceptorok ligand hiányában ? ellentétben a jelenleg elfogadott molekuláris kapcsoló modellel ? nagyrészt szabad állapotban vannak. Agonista hatására részleges átrendeződés történik egy alacsony mobilitású állapotba, amelyben a receptor feltehetően koaktivátort köt, és DNS-kötő affinitása megnő. | Interleukin-2 and -15 play an important role in regulating the function and homeostasis of T cell function. In our research we investigated the assembly, cell surface organization and interactions of the IL-2/15R complex with other membrane proteins in human T cells. We showed that MHC I glycoproteins play an organizing role in the assembly of IL-2/15R clusters. The stability of clusters formed by IL-2/15R and MHCI/II proteins does not critically depend on the cytoskeleton, associations remain stable on the surface of apoptotic blebs as well. We characterized the interactions of ILRAP, an IL-2R-associated protein, which may contribute to understanding the distinct effects of IL-2 and IL-15. We gave direct evidence of the trans presentation of IL-15 between two T lymphoma cell types. We elaborated a method for the measurement of FRET between GFP and mRFP. By using FRET, FCCS and MD-modeling the C terminal conformation of the Jun-Fos complex was characterized, which yielded implications for their mode of action. By measuring the mobility of RXR and RAR nuclear receptors and their functional mutants we demonstrated that receptors are in a freely diffusing state in the absence of ligand, which is in contrast to expectations of the molecular switch model. Agonist treatment yields a shift to a less mobile state, in which the receptor probably binds coactivator and has an increased DNA-binding affinity

Sejtfelszíni receptor minták mint lehetséges diagnosztikai eszközök = Cell surface receptor patterns as potential diagnostic tools

Modern biofizikai módszerek kombinált alkalmazásával (FRET, konfokális mikroszkópia, fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia, stb.) a T sejtes immunválaszban résztvevő kulcsfontosságú membránfehérjék sejtfelszíni elrendeződését, asszociációs mintázatait, kölcsönhatásait tanulmányoztuk. A kialakuló mintázatok a jelátvitel egyes lépéseinek szervezése révén alapvetően befolyásolják a sejtek fiziológiás működését, másrészről potenciális terápiás célpontok lehetnek. Megalkottuk az IL-2/15R rendszer dinamikus heterotetramer modelljét: a releváns citokin kötődése a receptor alegységek átrendezésével alakítja ki a megfelelő nagy affinitású heterotrimert. Kimutattuk, hogy az IL-2/15R és az MHC molekulák közös szuperklasztereket alkotnak a T sejtek lipid tutajaiban. Jurkat T sejteken és aktivált CTL-eken kimutattuk a Kv1.3 káliumcsatornák és a TCR kolokalizációját. A CTL-target sejt kölcsönhatás során a CTL-ek Kv1.3 csatornái feldúsulnak a két sejt közötti immunológiai szinapszisban, felvetve a TCR és a Kv1.3 kölcsönös szabályozásának lehetőségét. A korábban limfoid és kolorektális karcinóma sejteken feltárt, az MHC I, II és az ICAM-1 részvételével kialakuló asszociációs mintázatok jelenlétét uveális melanóma sejteken is kimutattuk. RNS interferencia felhasználásával igazoltuk, hogy a kolorektális karcinóma sejteken az MHC I és ICAM-1 klasztereit és domén szintű elrendeződését e két fehérje relatív expressziós szintje dinamikus módon szabályozza. | We investigated the cell surface distribution, association motifs and interactions of key membrane proteins involved in T cell mediated immune responses by applying modern biophysical techniques (FRET, confocal microscopy, fluorescence correlation spectroscopy, etc.). The studied protein patterns have a profound influence on the physiological function of the cells via organizing certain signaling steps, and may serve as potential therapeutic targets. We proposed a dynamic heterotetrameric model for the IL-2/15R system: binding of the cytokine rearranges the receptor subunits to form the relevant heterotrimeric high affinity receptor. We demonstrated that IL-2/15 receptors and MHC glycoproteins form superclusters in lipid rafts of T cells. We showed that Kv1.3 K+ channels and TCR are colocalized on Jurkat T cells and CTLs. Kv1.3 channels are enriched in the immune synapse formed between the CTL and the target cell, raising the possibility of reciprocal regulation of TCR and Kv1.3. We identified association patterns of MHC I, II and ICAM-1 on uveal melanoma cells similar to those previously found on lymphoid and colorectal carcinoma cells. By using RNA interference we demonstrated that the clusterization and interaction of MHC I and ICAM-1 are dynamically regulated by the relative expression levels of these proteins

A transzmembrán jelátvitel integrált szabályozása: Ca2+-, K+-csatornák és interleukin-receptorok közötti interakciók = An integrated regulation of transmembrane signalling: interactions between Ca2+, K+ channels and interleukin receptors

Projektünk célkitűzése a transzmembrán jelátvitelben résztvevő egyes receptorok és ioncsatornák működésének multidiszciplináris megközelítése volt. Kimutattuk a TASK-3 K+-csatorna expresszióját és döntően mitokondriális lokalizációját melanoma malignum, ill. malignus transzformációt nem mutató sejteken egyaránt. Jellemeztük a dendritikus sejtek (DS) érése és ioncsatorna expressziója közötti kapcsolatot. Feltártuk, hogy az elsődleges Ca2+ jelátviteli utat a CRAC csatornák biztosítják, függetlenül a DS-ek differenciáltsági fokától. Tanulmányoztuk az ic. Ca2+ homeosztázis és a purinerg jelátvitel kapcsolatát ingerlékeny és nem-ingerlékeny sejteken és karakterizáltuk a folyamatban szerepet játszó purinoreceptorok típusát. Kimutattuk, hogy az SR-ban kifejeződő Trisk 95 fehérje negatívan szabályozza a RyR funkcióját; így mind a lokális, mind pedig a globális Ca2+-jelek kialakulását gátolja. Rámutattunk, hogy a közös gamma receptorcsaládba tartozó IL-2/15 és -9 receptorok sejtfelszíni szerveződését feltehetően azonos rendező elvek alakítják ki. Tanulmányoztuk a T sejtek membránpotenciálját meghatározó Kv1.3 K+-csatorna immunszinapszis-beli lokalizációjának funkcionális következményeit. Kidolgoztunk egy újfajta FRET mérési módszert, amivel az IL-2 útvonal által aktivált transzkripciós faktorok konformációját határoztuk meg. Eredményeink hozzásegítenek a T-sejtes immunválasz mechanizmusának megértéséhez. | The main aim of our project was to characterize selected receptors and ion channels in transmembrane signaling processes using a multidisciplinary approach. We detected expression and mainly mitochondrial localization of TASK-3 K+-channels both in malignant melanomas and benign melanocytes. We described the relationship between maturation and ion channel expression in dendritic cells (DCs). We showed that the primary Ca2+ signaling pathway is mediated by CRAC channels, independent of the degree of maturation. We studied the connection between Ca2+ homeostasis and purinerg signaling in excitable and non-excitable cells, and characterized the type of purinerg receptors involved in this process. We demonstrated that the Trisk 95 protein expressed in the SR negatively regulates RYR function; thus it inhibits the generation of both local and global Ca2+ signals. We revealed that the cell surface organization of the members of the common gamma chain family, IL-2/15 and 9 receptors, is probably organized by the same general principles. We studied the functional consequences of the localization of Kv1.3 K+ channels in the immune synapse. We elaborated a new FRET method, by which we described the conformation of transcription factors induced by the IL-2 pathway. Our results contribute to understanding the mechanism of T cell mediated immune responses