Importância funcional de novas variações nucleotídicas no gene CYP21A2

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Svetlana Lajic, Michela BarbaroTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A Hiperplasia Adrenal Congênita (HAC), uma das desordens autossômicas recessivas mais frequentes, é causada pela deficiência de enzimas esteroidogênicas envolvidas na biossíntese do cortisol. Uma consequência disto é o desvio da síntese para a produção de hormônios androgênicos. Na forma clássica da HAC, a exposição pré-natal intrauterina ao excesso de andrógenos durante estágios críticos da diferenciação sexual leva à virilização da genitália externa de fetos 46,XX resultando em uma genitália ambígua ao nascimento, à pseudopuberdade precoce em ambos os sexos e à crises de perda de sal quando a atividade residual enzimática é menor que 1%. Sinais de excesso de andrógeno na forma não clássica podem ser acne, hirsutismo e desordens menstruais em mulheres jovens, contudo podem se manifestar anteriormente no desenvolvimento como: puberdade precoce, crescimento linear acelerado e maturação óssea avançada. Todavia, é bem conhecido que alguns indivíduos com HAC não clássica podem permanecer assintomáticos. Os objetivos deste projeto foram analisar o papel funcional de dez novas mutações (p.Leu12Met; p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro), uma nova deleção in frame (p.Gln398_Ala391del), duas mutações que foram descritas anteriormente, entretanto sem estudos funcionais (p.Ser113Phe e p.Thr450Pro) e três combinações de mutações in cis (p.Ile172Asn+p.Val358Ile; p.Val281Leu+p.Arg369Gln; e p.Asp377Tyr+p.Leu461Pro); e estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo para as mutações investigadas in vitro. Além dos métodos clássicos para os estudos moleculares, a metodologia deste estudo incluiu a expressão das proteínas CYP21A2 normal e mutantes para os ensaios de determinação da atividade enzimática e da cinética enzimática, bem como a verificação da expressão proteica por Western blot. Estudos in vitro demostraram que uma mutação é uma variante normal do gene CYP21A2 (p.Leu12Met) apresentando atividade residual próxima de 100%, nove (p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro) se associam à forma não clássica leve de HAC com atividades residuais entre 35% e 95% e, três (p.Ser113Phe, p.Gln398_Ala391del e p.Thr450Pro) resultam em HAC forma clássica com atividades residuais abaixo de 4%. As três combinações de mutações in cis apresentaram efeito sinergístico na atividade residual enzimática. Este estudo permitiu uma correta correlação genótipo-fenótipoAbstract: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH), one of the most frequent autosome recessive disorders, is caused by defects in steroidogenic enzymes involved in the cortisol biosynthesis. One consequence is the deviation of the synthesis towards the production of androgenic hormones. In the CAH classical form, intrauterine prenatal exposure to androgen excess in critical stages of sexual differentiation leads to external genitalia virilization of the 46,XX fetus resulting in ambiguous genitalia at birth, pseudopuberty in both sexes and salt wasting crisis when CYP21A2 residual activity is less than 1%. Signs of androgen excess in the non-classic form can be acne, hirsutism and menstrual disorders in young women but they can manifest early in development as precocious pubarche, accelerated linear growth and advanced skeletal maturation. However, it is well known that some individuals with non-classic CAH can remain asymptomatic. The objectives of this project were to analyze the functional role of ten novel CYP21A2 missense mutations (p.Leu12Met; p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; and p.Leu461Pro), one novel in frame deletion (p.Gln398_Ala391del), two mutations that has previously been identified but lacking functional studies (p.Ser113Phe and p.Thr450Pro) and three combined alleles (p.Ile172Asn+p.Val358Ile; p.Val281Leu+p.Arg369Gln; and p.Asp377Tyr+p.Leu461Pro); and establish a genotype-phenotype correlation for the mutations investigated in vitro. Besides all classic methods used in molecular studies, the methodology included the expression of normal and mutant CYP21A2 proteins for enzymatic activity assays and enzymatic kinetics as well as the verification of protein expression by Western blot. In vitro studies showed that one mutation is a normal variant of the CYP21A2 gene (p.Leu12Met) showing residual activity close to 100%; nine (p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; and p.Leu461Pro) result in mild non-classic CAH with residual activities varying between 35% and 95% and three result in classic CAH (p.Ser113Phe; p.Gln398_Ala391del and p.Thr450Pro) with residual activities below 4%. Alleles harboring two mutations in cis result in a synergistic effect on the enzyme residual activity. This study allowed the correlation between phenotype and genotypeDoutoradoGenetica Animal e EvoluçãoDoutora em Genética e Biologia Molecular2012/16815-0, 2014/09844-0FAPES

A de novo mutation in CYP21A2 gene in a case of in vitro fertilization

Congenital adrenal hyperplasia, one of the most frequent autosome recessive disorders, is caused by defects in steroidogenic enzymes involved in the cortisol biosynthesis. Approximately 95% of the cases are caused by abnormal function of the 21-hydroxylase enzyme. This deficiency leads to androgen excess, consequently, to virilization and rapid somatic growth with accelerated skeletal maturation. Mutations in CYP21A2 are responsible for different forms of 21-hydroxylase deficiency. Mild impairment in the enzymatic activity causes the non-classic or late-onset congenital adrenal hyperplasia that is observed with a prevalence of 1 in 1000 subjects in different populations. The present paper describes a de novo mutation that occurred in the paternal meiosis. The child, who was conceived by in vitro fertilization, presented with precocious puberty and diagnosed with non-classical 21-hydroxylase deficiency. DNA sequencing showed the compound heterozygosis for a de novo CYP21A1P/A2 chimeric gene and the p.Val281Leu mutation inherited from her mother, who was heterozygous for the mutation. The chimeric gene showed pseudogene-derived sequence from 5′-end to intron 3 and CYP21A2 sequences from intron 3 to 3′-end of the gene. Sequencing analysis of the father did not show any mutation. The multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) assay did not indicate loss of DNA discarding gene deletion but confirmed the chimeric gene. In addition, supernumerary copies of CYP21A1P were observed for both parents and for the affect child. Since paternity has been confirmed, those results suggest that a de novo large gene conversion in the paternal meiosis could have occurred by misalignment of alleles bearing different copy numbers of genes in CYP21 locus

Prevalência de anormalidades genitais em recém-nascidos Prevalence of genital abnormalities in neonates

OBJETIVOS: Avaliar a prevalência e descrever alterações da morfologia genital em recém-nascidos em duas maternidades-escola de gestão pública. MÉTODOS: Estudo caso/controle, descritivo, transversal. Utilizou-se protocolo clínico para avaliação da morfologia genital de 2.916 recém-nascidos entre 19/04/2010 e 18/04/2011. O grupo controle foi formado pelos nascimentos sem anormalidades morfológicas ocorridos no dia e na maternidade em que o caso foi detectado. Teste exato de Fisher foi utilizado para análises de variáveis categóricas, e de Kruskal-Wallis, para igualdade de médias. RESULTADOS: Foram detectados 29 recém-nascidos com anormalidade genital (1:100). A maioria (93,2%) foi examinada nos três primeiros dias de vida e apresentava apenas uma anormalidade. Os defeitos morfológicos compreenderam: ambiguidade genital evidente (1/29), fusão posterior de grandes lábios (1/29), micropênis (2/29), clitoromegalia (6/29), criptorquidia bilateral (6/29), hipospádia (9/29) e defeitos combinados (4/29) casos. Em apenas um caso os campos da Declaração de Nascido Vivo foram preenchidos corretamente. Prematuridade foi observada em 13/29, sendo esta a única variável estatisticamente associada à presença de anormalidade genital. Oito casos aderiram à proposta de investigação complementar, entre os quais três tiveram diagnóstico clínico de distúrbio da diferenciação do sexo. CONCLUSÕES: Evidenciou-se alta prevalência, subdiagnóstico e sub-registro de defeitos genitais nas maternidades estudadas. Os resultados reforçam a importância do exame cuidadoso de recém-nascidos com o objetivo de identificar anormalidades genitais sutis que podem compor o quadro clínico de distúrbio da diferenciação do sexo.OBJECTIVES: To assess the prevalence of genital abnormalities among neonates in two public maternity-schools. METHODS: Case-control, cross-sectional descriptive study. Genital morphology of 2,916 neonates was assessed using a clinical protocol between 04/19/2010 and 04/18/2011. Control group included neonates without birth defects, born at the same maternity unit and in the same day in which a case was identified. Fisher and Kruskal-Wallis tests were used for statistics. RESULTS: The study identified 29 (1:100) neonates with genital abnormalities. Most of them were examined within 3 days of life and presented only one genital defect. Morphological abnormalities comprised: genital ambiguity (1/29), fusion of labia majora (1/29), micropenis (2/29), enlarged clitoris (6/29), hypospadia (9/29), and combined defects (4/29). Only one case reported the genital abnormality in the statement of live birth correctly. Prematurity occurred in 13/29 cases and was the only variable statistically associated with genital defects. Eight cases agreed on the complementary investigation of the genital defect, among which three were diagnosed with disorder of sex development. CONCLUSIONS: There is a high prevalence of genital abnormalities in the maternity units included in the present study and most cases are under-diagnosed and under-reported. Our results reinforce the importance of a careful examination of genital morphology in neonatal period towards the recognition of minor defects that can be clinical features of a disorder of sex development

Prevalence of genital abnormalities in neonates

OBJECTIVES: To assess the prevalence of genital abnormalities among neonates in two public maternity-schools. METHODS: Case-control, cross-sectional descriptive study. Genital morphology of 2,916 neonates was assessed using a clinical protocol between 04/19/2010 and 04/18/2011. Control group included neonates without birth defects, born at the same maternity unit and in the same day in which a case was identified. Fisher and Kruskal-Wallis tests were used for statistics. RESULTS: The study identified 29 (1:100) neonates with genital abnormalities. Most of them were examined within 3 days of life and presented only one genital defect. Morphological abnormalities comprised: genital ambiguity (1/29), fusion of labia majora (1/29), micropenis (2/29), enlarged clitoris (6/29), hypospadia (9/29), and combined defects (4/29). Only one case reported the genital abnormality in the statement of live birth correctly. Prematurity occurred in 13/29 cases and was the only variable statistically associated with genital defects. Eight cases agreed on the complementary investigation of the genital defect, among which three were diagnosed with disorder of sex development. CONCLUSIONS: There is a high prevalence of genital abnormalities in the maternity units included in the present study and most cases are under-diagnosed and under-reported. Our results reinforce the importance of a careful examination of genital morphology in neonatal period towards the recognition of minor defects that can be clinical features of a disorder of sex development.OBJETIVOS: Avaliar a prevalência e descrever alterações da morfologia genital em recém-nascidos em duas maternidades-escola de gestão pública. MÉTODOS: Estudo caso/controle, descritivo, transversal. Utilizou-se protocolo clínico para avaliação da morfologia genital de 2.916 recém-nascidos entre 19/04/2010 e 18/04/2011. O grupo controle foi formado pelos nascimentos sem anormalidades morfológicas ocorridos no dia e na maternidade em que o caso foi detectado. Teste exato de Fisher foi utilizado para análises de variáveis categóricas, e de Kruskal-Wallis, para igualdade de médias. RESULTADOS: Foram detectados 29 recém-nascidos com anormalidade genital (1:100). A maioria (93,2%) foi examinada nos três primeiros dias de vida e apresentava apenas uma anormalidade. Os defeitos morfológicos compreenderam: ambiguidade genital evidente (1/29), fusão posterior de grandes lábios (1/29), micropênis (2/29), clitoromegalia (6/29), criptorquidia bilateral (6/29), hipospádia (9/29) e defeitos combinados (4/29) casos. Em apenas um caso os campos da Declaração de Nascido Vivo foram preenchidos corretamente. Prematuridade foi observada em 13/29, sendo esta a única variável estatisticamente associada à presença de anormalidade genital. Oito casos aderiram à proposta de investigação complementar, entre os quais três tiveram diagnóstico clínico de distúrbio da diferenciação do sexo. CONCLUSÕES: Evidenciou-se alta prevalência, subdiagnóstico e sub-registro de defeitos genitais nas maternidades estudadas. Os resultados reforçam a importância do exame cuidadoso de recém-nascidos com o objetivo de identificar anormalidades genitais sutis que podem compor o quadro clínico de distúrbio da diferenciação do sexo.48949

Prevalência de anormalidades genitais em recém-nascidos

OBJETIVOS: Avaliar a prevalência e descrever alterações da morfologia genital em recém-nascidos em duas maternidades-escola de gestão pública. MÉTODOS: Estudo caso/controle, descritivo, transversal. Utilizou-se protocolo clínico para avaliação da morfologia genital de 2.916 recém-nascidos entre 19/04/2010 e 18/04/2011. O grupo controle foi formado pelos nascimentos sem anormalidades morfológicas ocorridos no dia e na maternidade em que o caso foi detectado. Teste exato de Fisher foi utilizado para análises de variáveis categóricas, e de Kruskal-Wallis, para igualdade de médias. RESULTADOS: Foram detectados 29 recém-nascidos com anormalidade genital (1:100). A maioria (93,2%) foi examinada nos três primeiros dias de vida e apresentava apenas uma anormalidade. Os defeitos morfológicos compreenderam: ambiguidade genital evidente (1/29), fusão posterior de grandes lábios (1/29), micropênis (2/29), clitoromegalia (6/29), criptorquidia bilateral (6/29), hipospádia (9/29) e defeitos combinados (4/29) casos. Em apenas um caso os campos da Declaração de Nascido Vivo foram preenchidos corretamente. Prematuridade foi observada em 13/29, sendo esta a única variável estatisticamente associada à presença de anormalidade genital. Oito casos aderiram à proposta de investigação complementar, entre os quais três tiveram diagnóstico clínico de distúrbio da diferenciação do sexo. CONCLUSÕES: Evidenciou-se alta prevalência, subdiagnóstico e sub-registro de defeitos genitais nas maternidades estudadas. Os resultados reforçam a importância do exame cuidadoso de recém-nascidos com o objetivo de identificar anormalidades genitais sutis que podem compor o quadro clínico de distúrbio da diferenciação do sexo