Estudio de variaciones genéticas de cepas de Nocardia brasiliensis, basado en técnicas de restricción enzimática

El actinomicetoma es una enfermedad crónica extensiva, altamente incapacitante y de mal pronóstico; los principales agentes causales son los géneros Nocardia, Streptomyces, Actinomadura y Rhodococcus pertenecientes al orden Actinomycetales. En México, el agente aislado con mayor frecuencia es Nocardia brasiliensis, el cual posee peculiaridades en su clasificación taxonómica secundarias a la alta semejanza fenotípica interespecie, causando que durante casi dos siglos fuera poco conocida y reclasificada con base en criterios limitados. Es hasta el advenimiento de la biología molecular que la identificación de estas bacterias adquiere un alcance mayor, siendo descritas 119 especies hasta la actualidad. N. brasiliensis había sido inicialmente descrita como una especie fenotípicamente homogénea, pero en las últimas décadas se ha demostrado que existe en su perfil bioquímico, de susceptibilidad a antibióticos y en algunas secuencias de nucleótidos, una alta variabilidad antes no considerada. El uso de métodos moleculares, por medio de herramientas informáticas o in silico, que permitan identificar puntualmente estas diferencias a nivel genético podría ayudar a ampliar los conocimientos que se tienen sobre esta especie, analizar y comparar los patrones genéticos, establecer grupos que formen subespecies o genotipos y, finalmente, explicar la alta variabilidad observada. Se realizó un estudio descriptivo y transversal, en el cual se identificaron y analizaron los patrones de restricción del gen ARNr 16S de 78 cepas de N. brasiliensis aisladas de casos clínicos. El proyecto se inició reactivando las cepas, estas se encontraban conservadas en criotubos a -20°C, para ello se inocularon en agar Sabouraud y agar infusión cerebro corazón con adición de papa al 10% a 37°C por 21 a 35 días. Posteriormente se obtuvo biomasa y se realizó la extracción del material genético por medio del kit Promega Wizard® Genomic. Con el ADN obtenido se amplificó el gen ARNr 16S por medio de PCR. El producto de amplificación fue secuenciado. Se construyeron secuencias consenso por métodos bioinformáticos, con las cuales se realizó la identificación genética de las cepas. Así mismo, las secuencias construidas fueron utilizadas para la realización de las restricciones enzimáticas in silico por medio de la herramienta virtual de New England BioLabs® NEBcutter. Se utilizaron las enzimas NspI y SfcI. Los patrones generados se analizaron en busca de variaciones y se establecieron las agrupaciones correspondientes según las características presentadas. Finalmente, fueron identificados 12 grupos o ribotipos que cumplieron con los criterios de agrupación establecidos, dentro de los cuales se hallaron 63 de las 78 cepas estudiadas; mientras que 6 más pudieron agruparse sin cumplir exitosamente los criterios y 9 más no presentaron semejanzas y no pudieron ser agrupadas

Genetic variability of the 16S rRNA gene of Nocardia brasiliensis, the most common causative agent of actinomycetoma in Latin America and the Caribbean

Mycetoma is a neglected tropical disease (NTD) declared by the World Health Organization (WHO) in 2016. It is characterized by the progressive growth of nodules and granulomatous lesions on the legs, arms, and trunk. It is potentially disfiguring and causes disability or amputations in working-age people from marginalized areas. The causative agents can be fungi (eumycetoma) or actinobacteria (actinomycetoma), the latter being the most common in America and Asia. Nocardia brasiliensis is the most important causal agent of actinomycetoma in the Americas. Taxonomic problems have been reported when identifying this species, so this study aimed to detect the 16S rRNA gene variations in N. brasiliensis strains using an in silico enzymatic restriction technique. The study included strains from clinical cases of actinomycetoma in Mexico, isolated from humans and previously identified as N. brasiliensis by traditional methods. The strains were characterized microscopically and macroscopically, then subjected to DNA extraction and amplification of the 16S rRNA gene by PCR. The amplification products were sequenced, and consensus sequences were constructed and used for genetic identification and in silico restriction enzyme analysis with the New England BioLabs® NEBcutter program. All study strains were molecularly identified as N. brasiliensis; however, in silico restriction analysis detected a diversity in the restriction patterns that were finally grouped and subclassified into 7 ribotypes. This finding confirms the existence of subgroups within N. brasiliensis. The results support the need to consider N. brasiliensis as a complex species