Biochemical characterization of phospholipases D and their functional domains : novel method for measuring phospholipase D activities.

La phospholipase D (PLD) hydrolyse les phospholipides membranaires en libérant leur tête polaire afin de générer l'acide phosphatidique (PA), impliqué dans la signalisation cellulaire. Pour comprendre les propriétés biochimiques des PLDs, les travaux présentés ont été réalisés autour de deux axes. Le premier axe concerne l'expression recombinante et la purification de la PLDa d'Arabidopsis thaliana (AtPLDa) dans la levure Pichia pastoris. La détermination de la séquence N-terminale a révélé que l'AtPLDa est amputée de ses 35 premiers résidus, suggérant ainsi la participation d'un mécanisme de maturation. Cependant, la région N-terminale des PLDs de plantes est homologue au domaine C2, impliqué dans leur interaction Ca2+-dépendante avec la membrane. Afin d'évaluer l'impact d'un tel clivage, les domaines C2 de l'AtPLDa mais également de l'AtPLDß, à titre de comparaison, ont été étudiés sous leur forme entière ou mature. Ainsi, la caractérisation de leur affinité pour les phospholipides, associée à leur modélisation tridimensionnelle, ont permis de démontrer que les différences de régulation par le Ca2+, observées entre les formes entières et mature, provenait de la présence d'une hélice a amphipathique, retirée lors du processus de maturation. Le second axe concerne le développement d'une nouvelle méthode de mesure des activités PLD via le dosage de manière direct, spécifique et continu du PA grâce à la propriété d'amplification de fluorescence par chélation de la 8-hydroxyquinoléine, en présence de Ca2+. Ainsi, ce test apparait adapté pour le suivi de l'inhibition des PLDs et pour l'étude de leur spécificité de substrat, en utilisant des phospholipides naturels avec différentes tête polaires, et à l'échelle d'une microplaquePhospholipase D (PLD) hydrolyses membrane phospholipids, leading to the formation of free polar headgroup and phosphatidic acid releasing, involved in cell signaling. To understand the biochemical properties of PLDs, this work has been made around two axes. The one first concerns the recombinant expression and purification of the PLDa of Arabidopsis thaliana (AtPLDa) in the yeast Pichia pastoris. The N-terminal sequence of the recombinant AtPLDa has been determined and found to lack its first 35 amino acids, suggesting the involvement of a maturing mechanism. However, plant PLDs exhibit a C2-lipid binding domain at their N-terminal region, which is involved in their Ca2+-dependent membrane targeting. Thus, to assess the impact of such a cleavage, whole and mature-like C2 domains of AtPLDa, as well as of AtPLDß, for the sake of comparison were studied. Thus, the characterization of their affinity for phospholipids, combined with their three-dimensional modeling have demonstrated that the differences observed in their regulation by Ca2+, observed between whole and mature-like forms, originated from the presence of a N-terminus amphipathic a helix, removed during the maturation process. The second axis concerns the development of a novel PLD assay that measure PA in a direct, specific and continuous manner, using the chelation enhanced fluorescence property of 8-hydroxyquinoline in the presence of Ca2+. Thus, this assay appears suitable for monitoring both the inhibition of PLDs as well as their substrate specificity, using natural phospholipids with different polar headgroups, and at a microplate scal

Caractérisation biochimique des phospholipases D et de leurs domaines fonctionnels : nouvelle méthode de mesure de l’activité phospholipase D

Phospholipase D (PLD) hydrolyses membrane phospholipids, leading to the formation of free polar headgroup and phosphatidic acid releasing, involved in cell signaling. To understand the biochemical properties of PLDs, this work has been made around two axes. The one first concerns the recombinant expression and purification of the PLDa of Arabidopsis thaliana (AtPLDa) in the yeast Pichia pastoris. The N-terminal sequence of the recombinant AtPLDa has been determined and found to lack its first 35 amino acids, suggesting the involvement of a maturing mechanism. However, plant PLDs exhibit a C2-lipid binding domain at their N-terminal region, which is involved in their Ca2+-dependent membrane targeting. Thus, to assess the impact of such a cleavage, whole and mature-like C2 domains of AtPLDa, as well as of AtPLDß, for the sake of comparison were studied. Thus, the characterization of their affinity for phospholipids, combined with their three-dimensional modeling have demonstrated that the differences observed in their regulation by Ca2+, observed between whole and mature-like forms, originated from the presence of a N-terminus amphipathic a helix, removed during the maturation process. The second axis concerns the development of a novel PLD assay that measure PA in a direct, specific and continuous manner, using the chelation enhanced fluorescence property of 8-hydroxyquinoline in the presence of Ca2+. Thus, this assay appears suitable for monitoring both the inhibition of PLDs as well as their substrate specificity, using natural phospholipids with different polar headgroups, and at a microplate scaleLa phospholipase D (PLD) hydrolyse les phospholipides membranaires en libérant leur tête polaire afin de générer l'acide phosphatidique (PA), impliqué dans la signalisation cellulaire. Pour comprendre les propriétés biochimiques des PLDs, les travaux présentés ont été réalisés autour de deux axes. Le premier axe concerne l'expression recombinante et la purification de la PLDa d'Arabidopsis thaliana (AtPLDa) dans la levure Pichia pastoris. La détermination de la séquence N-terminale a révélé que l'AtPLDa est amputée de ses 35 premiers résidus, suggérant ainsi la participation d'un mécanisme de maturation. Cependant, la région N-terminale des PLDs de plantes est homologue au domaine C2, impliqué dans leur interaction Ca2+-dépendante avec la membrane. Afin d'évaluer l'impact d'un tel clivage, les domaines C2 de l'AtPLDa mais également de l'AtPLDß, à titre de comparaison, ont été étudiés sous leur forme entière ou mature. Ainsi, la caractérisation de leur affinité pour les phospholipides, associée à leur modélisation tridimensionnelle, ont permis de démontrer que les différences de régulation par le Ca2+, observées entre les formes entières et mature, provenait de la présence d'une hélice a amphipathique, retirée lors du processus de maturation. Le second axe concerne le développement d'une nouvelle méthode de mesure des activités PLD via le dosage de manière direct, spécifique et continu du PA grâce à la propriété d'amplification de fluorescence par chélation de la 8-hydroxyquinoléine, en présence de Ca2+. Ainsi, ce test apparait adapté pour le suivi de l'inhibition des PLDs et pour l'étude de leur spécificité de substrat, en utilisant des phospholipides naturels avec différentes tête polaires, et à l'échelle d'une microplaqu

Caractérisation biochimique des phospholipases D et de leurs domaines fonctionnels : nouvelle méthode de mesure de l’activité phospholipase D

Phospholipase D (PLD) hydrolyses membrane phospholipids, leading to the formation of free polar headgroup and phosphatidic acid releasing, involved in cell signaling. To understand the biochemical properties of PLDs, this work has been made around two axes. The one first concerns the recombinant expression and purification of the PLDa of Arabidopsis thaliana (AtPLDa) in the yeast Pichia pastoris. The N-terminal sequence of the recombinant AtPLDa has been determined and found to lack its first 35 amino acids, suggesting the involvement of a maturing mechanism. However, plant PLDs exhibit a C2-lipid binding domain at their N-terminal region, which is involved in their Ca2+-dependent membrane targeting. Thus, to assess the impact of such a cleavage, whole and mature-like C2 domains of AtPLDa, as well as of AtPLDß, for the sake of comparison were studied. Thus, the characterization of their affinity for phospholipids, combined with their three-dimensional modeling have demonstrated that the differences observed in their regulation by Ca2+, observed between whole and mature-like forms, originated from the presence of a N-terminus amphipathic a helix, removed during the maturation process. The second axis concerns the development of a novel PLD assay that measure PA in a direct, specific and continuous manner, using the chelation enhanced fluorescence property of 8-hydroxyquinoline in the presence of Ca2+. Thus, this assay appears suitable for monitoring both the inhibition of PLDs as well as their substrate specificity, using natural phospholipids with different polar headgroups, and at a microplate scaleLa phospholipase D (PLD) hydrolyse les phospholipides membranaires en libérant leur tête polaire afin de générer l'acide phosphatidique (PA), impliqué dans la signalisation cellulaire. Pour comprendre les propriétés biochimiques des PLDs, les travaux présentés ont été réalisés autour de deux axes. Le premier axe concerne l'expression recombinante et la purification de la PLDa d'Arabidopsis thaliana (AtPLDa) dans la levure Pichia pastoris. La détermination de la séquence N-terminale a révélé que l'AtPLDa est amputée de ses 35 premiers résidus, suggérant ainsi la participation d'un mécanisme de maturation. Cependant, la région N-terminale des PLDs de plantes est homologue au domaine C2, impliqué dans leur interaction Ca2+-dépendante avec la membrane. Afin d'évaluer l'impact d'un tel clivage, les domaines C2 de l'AtPLDa mais également de l'AtPLDß, à titre de comparaison, ont été étudiés sous leur forme entière ou mature. Ainsi, la caractérisation de leur affinité pour les phospholipides, associée à leur modélisation tridimensionnelle, ont permis de démontrer que les différences de régulation par le Ca2+, observées entre les formes entières et mature, provenait de la présence d'une hélice a amphipathique, retirée lors du processus de maturation. Le second axe concerne le développement d'une nouvelle méthode de mesure des activités PLD via le dosage de manière direct, spécifique et continu du PA grâce à la propriété d'amplification de fluorescence par chélation de la 8-hydroxyquinoléine, en présence de Ca2+. Ainsi, ce test apparait adapté pour le suivi de l'inhibition des PLDs et pour l'étude de leur spécificité de substrat, en utilisant des phospholipides naturels avec différentes tête polaires, et à l'échelle d'une microplaqu

Identification des Principaux Constituants des Huiles Essentielles par RMN du Carbone-13. Etude de la Variabilite Chimique de Thymus Herba-Barona Lois

SIGLEINIST T 77667 / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

Analyse des mélanges complexes par RMN du carbone 13. Application aux huiles essentielles

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Les flavonoïdes de Thymus herba barona

International audienceChromatographic and structural studies were curled out in order to investigate flavonic composition of seven terpenic chemotypes of Thymus herba-barona Loïs. The qualitative analysis was carried out by means of HPLC, and structural identification of compounds isolated by TLC was -established by means of UV , mass and 1H RMN spectroscopy. We have identified two flavanones and eleven flavones. Except sorbifoline and cirsiliol, aIl identified compounds are found in other thymus species. Since Xanthomicrol is the main product or almost terpenic chemotypes or this species chromatographic profils showed a greater homogeneity of flavonic composition than terpenic composition

Concentration des hydrolats par osmose inverse

International audienceThe limited company MONTIER, in collaboration with the CRITT Corse Technologie, the CE V A.REN and the limited company MILLIPORE elaborated a process of hydrolates concentration by reverse osmosis from a pilot monitored by a microprocessor The computerization of the process makes it possible to adapt a process to each product. Hydrolates are usually used in the pharmaceutical and cosmetology products because of the active principles or flavours which they contain. Thanks to this process we can concentrate these compounds by nanofiltration on membrane. The drainage of water is carried out without heating nor treatment which can deteriorate the molecules. We have made studies on various hydrolates which allows us to define the maximum concentration which can be reached, the time necessary to this concentration and the chemical composition. The analysis of concentrated hydrolate is compared with that of initial hydrolate as well as that of essential oil. This study focuses on the presence of some compounds in hydrolate at amounts higher than in essential oil We present two studies carried out from vegetable species growing at the spontaneous state in Corsica and exploited by the insular producers: (i) Rosemary (Rosmarinus ofjicinallis), (ii) Myrtle (Myrtus communis). The concentration of the hydrolates presents some economic advantages (conditioning transport) and facilitates one possible extraction or the active principles or their redilution to the expected concentration Moreover, the product obtained seems to have a better stability

Free flavonoid aglycones from Thymus Herba Barona and its monoterpenoid chemotypes

International audienceFrom the diethyl ether extracts of the aerial parts of Thymus herba barona, the flavanones eriodictyol,naringenin and the flavones luteolin, sorbifolin, thymusin, cirsiliol, apigenin, sideritoflavone, cirsimaritin, cirsilineol, xanthomicrol, 8-methoxycirsilineol and genkwanin were isolated and characterized. This is the first report of sorbifolin and cirsiliol in the genus Thymus. The distribution of these flavonoids in the seven terpenoid chemotypes of T. herba barona growing in Corsica was studied and the chemotaxonomic implications of this data discussed

Hydrogen bonding effect on Carbon-13 NMR chemical shifts of naturally occurring phenols

International audienc