Sequencing and characterization of gene AlkB Caulobacter crescentus

Caulobacter crescentus é uma bactéria gram-negativa que dá origem a duas células filhas a cada divisão celular, a célula móvel e a célula talo, que se distinguem por sua morfologia, programa de desenvolvimento e capacidade de replicação do DNA. O gene alkB de C. crescentus foi identificado num clone que contém os genes de choque térmico dnaK e dnaJ (Gomes et al, 1990). Em E. coli, o gene alkB mostrou estar envolvido, juntamente com os genes alkA e ada, no reparo de lesões do DNA causadas por agentes alquilantes (Teo et al, 1986). O gene alkB de E coli forma um operon com o gene ada, sendo que o gene ada precede o gene alkB. A expressão de ambos os genes é induzida por doses não letais de agentes alquilantes, a nível de transcrição. A seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de nucleotídeos do gene alkB de Caulobacter crescentus mostrou uma identidade de 42,5 % com a proteína AlkB de E. coli (Kondo et al, 1986). Ao contrário do que ocorre em E.coli, este gene não faz parte de um operon com o gene ada e sua expressão não é induzida por agentes alquilantes. Através do ensaio de proteção à nuclease S1 foi demonstrada a existência de um único início de transcrição para este gene. Para medir o nível de expressão do gene alkB foi construída a fusão de transcrição alkB-placZ/290, onde o vetor repórter de transcricão (placZ/290) (Gober & Shapiro, 1992) contendo o gene da (β-galactosidase sem o seu promotor foi ligado ao fragmento Sall/Stul (0,3 kb) que contém apenas a região promotora do gene alkB. Observou-se que a transcrição do gene alkB é regulada durante o ciclo celular de Caulobacter crescentus, apresentando níveis máximos na célula talo. Verificou-se ainda, através do experimento de dupla sincronia, que a proteína AlkB de C. crescentus sintetizada na célula prédivisional é segregada tanto para a célula móvel como para a célula talo, não apresentando um padrão polar de expressão. A resposta adaptativa a agentes alquilantes foi demonstrada em C. crescentus pela detecção de um aumento na sobrevivência aos efeitos letais dos agentes alquilantes em células pré-tratadas com baixas doses destes agentes e pela identificação de uma proteína induzida por agentes alquilantes utilizando anticorpos monoclonais anti-Ada de E. coli.Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium that yields two different progeny cells at each division cycle, the swarmer cell and the stalked cell, which differ in structure, developmental program and ability to replicate DNA. The alkB gene in Caulobacter crescentus was identified in a clone which contains also the heat shock genes dnaK and dnaJ (Gomes et al, 1990). In Escherichia coli the alkB gene has been shown to be involved, with alkA and ada, in the pathway for repair of DNA alkylation damage (Teo et al, 1986). The E. coli alkB gene forms an operon with the ada gene, being downstream of it. The addition of the alkylating agent MMS to E. coli cultures induces the expression of both ada and alkB, at the level of transcription. The aminoacid sequence deduced from the nucleotide sequence of the C. crescentus alkB gene has shown 42,5% identity with the AlkB protein of E. coli (Kondo et al, 1986). Contrary to what happens in E. coli, the alkB gene of Caulobacter cescentus does not form an operon with the ada gene and its expression is not induced by alkylating agents. S1 nuclease protection assays have shown the presence of a single start of transcription for the alkB gene. To investigate the expression of the alkB gene during the cell cycle of the bacterium, its regulatory region was fused to a promoterless lacZ gene present in the vector placZJ290 (Gober & Shapiro, 1992), and β-galactosidase activity and synthesis, directed by the alkB gene promoter, were determined. It was observed that expression of the alkB gene is cell cycle controlled in Caulobacter. The placZJ290 transcriptional fusion with alkB, expressed in predivisional cells did not display a polar pattern of segregation in Caulobacter crescentus. β-galactosidase synthesized in predivisional cell was partitioned in equal amounts to both cell types after cell division. An adaptive response to alkylation damage has been demonstrated in C. crescentus. The response was detected by the increased resistance to cell killing of pretreated cells with low doses of methylating agents, followed by exposure to higher doses of these agents, and by cross-reactivity of an inducible protein of 39 kDa with E. coli anti-Ada monoclonal antibodies

Sequencing and characterization of gene AlkB Caulobacter crescentus

Caulobacter crescentus é uma bactéria gram-negativa que dá origem a duas células filhas a cada divisão celular, a célula móvel e a célula talo, que se distinguem por sua morfologia, programa de desenvolvimento e capacidade de replicação do DNA. O gene alkB de C. crescentus foi identificado num clone que contém os genes de choque térmico dnaK e dnaJ (Gomes et al, 1990). Em E. coli, o gene alkB mostrou estar envolvido, juntamente com os genes alkA e ada, no reparo de lesões do DNA causadas por agentes alquilantes (Teo et al, 1986). O gene alkB de E coli forma um operon com o gene ada, sendo que o gene ada precede o gene alkB. A expressão de ambos os genes é induzida por doses não letais de agentes alquilantes, a nível de transcrição. A seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de nucleotídeos do gene alkB de Caulobacter crescentus mostrou uma identidade de 42,5 % com a proteína AlkB de E. coli (Kondo et al, 1986). Ao contrário do que ocorre em E.coli, este gene não faz parte de um operon com o gene ada e sua expressão não é induzida por agentes alquilantes. Através do ensaio de proteção à nuclease S1 foi demonstrada a existência de um único início de transcrição para este gene. Para medir o nível de expressão do gene alkB foi construída a fusão de transcrição alkB-placZ/290, onde o vetor repórter de transcricão (placZ/290) (Gober & Shapiro, 1992) contendo o gene da (β-galactosidase sem o seu promotor foi ligado ao fragmento Sall/Stul (0,3 kb) que contém apenas a região promotora do gene alkB. Observou-se que a transcrição do gene alkB é regulada durante o ciclo celular de Caulobacter crescentus, apresentando níveis máximos na célula talo. Verificou-se ainda, através do experimento de dupla sincronia, que a proteína AlkB de C. crescentus sintetizada na célula prédivisional é segregada tanto para a célula móvel como para a célula talo, não apresentando um padrão polar de expressão. A resposta adaptativa a agentes alquilantes foi demonstrada em C. crescentus pela detecção de um aumento na sobrevivência aos efeitos letais dos agentes alquilantes em células pré-tratadas com baixas doses destes agentes e pela identificação de uma proteína induzida por agentes alquilantes utilizando anticorpos monoclonais anti-Ada de E. coli.Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium that yields two different progeny cells at each division cycle, the swarmer cell and the stalked cell, which differ in structure, developmental program and ability to replicate DNA. The alkB gene in Caulobacter crescentus was identified in a clone which contains also the heat shock genes dnaK and dnaJ (Gomes et al, 1990). In Escherichia coli the alkB gene has been shown to be involved, with alkA and ada, in the pathway for repair of DNA alkylation damage (Teo et al, 1986). The E. coli alkB gene forms an operon with the ada gene, being downstream of it. The addition of the alkylating agent MMS to E. coli cultures induces the expression of both ada and alkB, at the level of transcription. The aminoacid sequence deduced from the nucleotide sequence of the C. crescentus alkB gene has shown 42,5% identity with the AlkB protein of E. coli (Kondo et al, 1986). Contrary to what happens in E. coli, the alkB gene of Caulobacter cescentus does not form an operon with the ada gene and its expression is not induced by alkylating agents. S1 nuclease protection assays have shown the presence of a single start of transcription for the alkB gene. To investigate the expression of the alkB gene during the cell cycle of the bacterium, its regulatory region was fused to a promoterless lacZ gene present in the vector placZJ290 (Gober & Shapiro, 1992), and β-galactosidase activity and synthesis, directed by the alkB gene promoter, were determined. It was observed that expression of the alkB gene is cell cycle controlled in Caulobacter. The placZJ290 transcriptional fusion with alkB, expressed in predivisional cells did not display a polar pattern of segregation in Caulobacter crescentus. β-galactosidase synthesized in predivisional cell was partitioned in equal amounts to both cell types after cell division. An adaptive response to alkylation damage has been demonstrated in C. crescentus. The response was detected by the increased resistance to cell killing of pretreated cells with low doses of methylating agents, followed by exposure to higher doses of these agents, and by cross-reactivity of an inducible protein of 39 kDa with E. coli anti-Ada monoclonal antibodies

Cloning and expression of Hep region domain heparin filamentous hemagglutinin protein (FHA) of the pertussis bacteria Bordella in heterologous systems

Bordetella pertussis, o agente etiológico da coqueluche ou tosse comprida, que estabelece a infecção através da fixação bacteriana no epitélio do trato respiratório superior. Os principais mediadores de adesão da bactéria são a toxina pertússica (PT) e a hemaglutinina filamentosa (FHA). A FHA é a adesina majoritária e contém pelo menos 4 domínios: porção Nterminal, domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) (FHA1141-1279), trinca de aminoácidos Arginina-Glicina-Ácido aspártico (RGD) (FHA1097-1099) e o sítio de ligação a heparina (domínio Hep) (FHA442-863). Neste trabalho, foi realizado a amplificação de duas regiões do domínio de ligação à heparina, as regiões MAL80 (FHA299-873) e HEP (FHA430-873). As regiões foram amplificadas, clonadas no vetor de expressão pAE, expressas utilizando a cepa BL21 SI de E. coli e purificadas. A proteína HEP purificada de E. coli possui baixa afinidade por heparina e não é capaz de aglutinar hemácias. A proteína recombinante HEP purificada foi utilizada para a produção de anticorpos. Através do experimento de ELISA foi demonstrado que o anti-soro anti-HEP é capaz de reconhecer além da região HEP, a região MAL80 e a proteína FHA. Estes resultados foram confirmados por experimentos de Western. Neste período também foi realizada a amplificação do domínio HEP de FHA e da subunidade S1 da toxina pertússica (PT) de B. pertussis através do método de TAP Express. Este método envolve duas reações de PCR e no final do processo é obtido um fragmento que contém uma região promotora (CMV), uma seqüência codificadora e uma região terminadora (SV40), que está pronto para ser introduzido e expresso em animais. De posse deste material e da proteína recombinante HEP, foi realizado o desafio intracerebral com Bordetella pertussis e através do monitoramento dos camundongos foi observado que nenhum dos candidatos testados foi capaz de proteger os animais contra B. pertussis. Foi realizado também a expressão do domínio Hep em lactobacilos, visando um possível sistema de imunizações de mucosas. Os anticorpos produzidos nos camundongos imunizados com a proteína HEP expressa em E. coli, lactobacilos e por vacina de DNA foram capazes de inibir a hemaglutinação promovida pela proteína FHA.Bordetelfa pertussis, the agent of whopping cough, establishes infection by attaching to the ciliated epithelial cells of the respiratory tract. The bacterial adherence is mediated by pertussis toxin and filamentous hemagglutinin (FHA). FHA is the major adhesin of B. pertussis and displays multipie adherence activities. FHA contains four distin\'ct domains that exhibit specific affinities for different ligands or receptor, the amino-terminal end, the RGD triplet (FHA1097-1099), the lectin domain (FHA1141-1279) and the heparin-binding domain (FHA442-863). In this study, two overlapping regions of the heparin-binding domain, Mal80 (FHA299-873) and Hep (FHA442-873), were amplified by peR and subcloned in pAE expression vectors for E. coli. The fusion proteins in pAE were transformed in E. coli BL21 SI, induced with NaCI 0,3 M and purified using a nickel-charged metal chelating resin. The purified protein has low heparin affinity and does not have hemagglutination activity. The purified protein HEP was used to produce polyclonal antibodies in mouse. The anti-HEP antibodies are able to recognize the HEP, MAL80 and FHA proteins in ELISA and western assays, but anti-FHA only recognized the FHA protein. The genetically detoxified S1 subunit of pertussis toxin and Hep domain were amplified by the TAP Express method. There are two PCR reactions involved in the TAP processo At the end of the process the fragment of interest will carry a CMV promoter and a SV40 terminator and is ready to be introduced into animals or cell by transfection. Groups were immunized with proteins and/or DNA, challenged i.c. with a lethal dose of live Bordetelfa pertussis and the survival was monitored. No groups were protected against the challenge. The recombinant protein HEP were also expressed in Lactobacilfus aiming the development of potential mucosal vaccines. The polyclonal antibodies produce in mouse immunized with DNA and protein Hep expressed in E. coli and Lactobacillus were able to inhibition the FHA hemagglutination activity

Da coisa julgada

Será coisa julgada a sentença da qual não caiba mais nenhum recurso.É um instituto que visa a segurança jurídica dos processos e está garantido na Constituição Federal.Encontramos a coisa julgada no código de Processo Penal, artigo 621.Apesar de ser um instituto de Direito Processual, está disposto também na Carta Magna, artigo 5°.XXXVI e em diversos ramos do Direito Material, como por exemplo, artigo 836 da Consolidação das Leis do Trabalho, artigo 156 Código Tributário Nacional e artigo 6° da Lei de Introdução ao Código Civil.Diferenciamos as espécies de coisa julgada formal e material , seus limites e os efeitos positivos e negativos do instituto.Abordamos a questão polêmica da flexibilização da coisa julgada e que esse suposto enfraquecimento do instituto pode acarretar. Citamos as correntes que são contrárias à ideia e atualmente são majoritárias, e também os doutrinadores que a defendem, como por exemplo, a professora Ada Pellegrini Grinover, que nos sugere a aplicação do princípio da proporcionalidade.Falamos sobre a Ciência do Direito, que deve acompanhar a evolução da sociedade e proporcionar a estabilidade social.E sobre a justiça, que nossa sociedade tanto almeja

ZmPUMP encodes a fully functional monocot plant uncoupling mitochondrial protein whose affinity to fatty acid is increased with the introduction of a His pair at the second matrix loop

Uncoupling proteins (UCPs) are specialized mitochondrial transporter proteins that uncouple respiration from ATP synthesis. In this study, cDNA encoding maize uncoupling protein (ZmPUMP) was expressed in Escherichia coli and recombinant ZmPUMP reconstituted in liposomes. ZmPUMP activity was associated with a linoleic acid (LA)-mediated H+ efflux with Km of 56.36 ± 0.27 μM and Vmax of 66.9 μmol H+ min-1 (mg prot)-1. LA-mediated H+ fluxes were sensitive to ATP inhibition with Ki of 2.61 ± 0.36 mM (at pH 7.2), a value similar to those for dicot UCPs. ZmPUMP was also used to investigate the importance of a histidine pair present in the second matrix loop of mammalian UCP1 and absent in plant UCPs. ZmPUMP with introduced His pair (Lys155His and Ala157His) displayed a 1.55-fold increase in LA-affinity while its activity remained unchanged. Our data indicate conserved properties of plant UCPs and suggest an enhancing but not essential role of the histidine pair in proton transport mechanism. © 2006 Elsevier Inc. All rights reserved

Microsatellite marker-based assessment of the biodiversity of native bioethanol yeast strains

Although many Brazilian sugar mills initiate the fermentation process by inoculating selected commercial Saccharomyces cerevisiae strains, the unsterile conditions of the industrial sugar cane ethanol fermentation process permit the constant entry of native yeast strains. Certain of those native strains are better adapted and tend to predominate over the initial strain, which may cause problems during fermentation. In the industrial fermentation process, yeast cells are often exposed to stressful environmental conditions, including prolonged cell recycling, ethanol toxicity and osmotic, oxidative or temperature stress. Little is known about these S. cerevisiae strains, although recent studies have demonstrated that heterogeneous genome architecture is exhibited by some selected well-adapted Brazilian indigenous yeast strains that display high performance in bioethanol fermentation. In this study, 11 microsatellite markers were used to assess the genetic diversity and population structure of the native autochthonous S. cerevisiae strains in various Brazilian sugar mills. The resulting multilocus data were used to build a similarity-based phenetic tree and to perform a Bayesian population structure analysis. The tree revealed the presence of great genetic diversity among the strains, which were arranged according to the place of origin and the collection year. The population structure analysis revealed genotypic differences among populations; in certain populations, these genotypic differences are combined to yield notably genotypically diverse individuals. The high yeast diversity observed among native S. cerevisiae strains provides new insights on the use of autochthonous high-fitness strains with industrial characteristics as starter cultures at bioethanol plants. © 2013 John Wiley & Sons, Ltd

Detection and quantification of Duffy antigen on bovine red blood cell membranes using a polyclonal antibody

As doenças infecciosas e parasitárias causam perdas importantes em vários setores da produção da pecuária mundial. Estima-se que mais de 600 milhões de bovinos de países tropicais e subtropicais estejam expostos à infecção por Babesia sp. gerando grande prejuízo econômico. Os gêneros Babesia e Plasmodium são hemoparasitas pertencentes ao filo Apicomplexa e apresentam características comuns no processo de invasão eritrocitária. A babesiose bovina causada por Babesia bigemina e Babesia bovis apresenta sinais clínicos similares a malária humana causada por Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum. A glicoproteína Duffy é a única receptora para o P. vivax em humanos. A maioria dos indivíduos negros africanos é resistente a este parasita devido a uma mutação que provoca a ausência de expressão desta glicoproteína na superfície das hemácias. Tendo em vista este fato, e que animais da subespécie Bos taurus taurus são mais susceptíveis à babesiose quando comparados à animais Bos taurus indicus, objetivou-se neste trabalho a detecção e quantificação do antígeno Duffy na superfície dos eritrócitos de bovinos empregando para tal, anticorpo policlonal que permitisse investigar se as diferenças na susceptibilidade são devido a diferentes níveis de expressão do antígeno Duffy nas hemácias. Ensaios de ELISA mostraram que o anticorpo produzido foi capaz de reconhecer o antígeno Duffy presente nas hemácias bovinas e a análise quantitativa não demonstrou diferença significativa na presença do mesmo. Estes resultados sugerem que a resistência maior dos zebuínos à babesiose não se deve à ausência de expressão, ou à presença em menor quantidade do antígeno Duffy na superfície de suas hemácias.Babesiosis is one of the most important diseases affecting livestock agriculture worldwide. Animals from the subspecies Bos taurus indicus are more resistant to babesiosis than those from Bos taurus taurus. The genera Babesia and Plasmodium are Apicomplexa hemoparasites and share features such as invasion of red blood cells (RBC). The glycoprotein Duffy is the only human erythrocyte receptor for Pasmodium vivax and a mutation which abolishes expression of this glycoprotein on erythrocyte surfaces is responsible for making the majority of people originating from the indigenous populations of West Africa resistant to P. vivax. The current work detected and quantified the Duffy antigen on Bos taurus indicus and Bos taurus taurus erythrocyte surfaces using a polyclonal antibody in order to investigate if differences in susceptibility to Babesia are due to different levels of Duffy antigen expression on the RBCs of these animals, as is known to be the case in human beings for interactions of Plasmodium vivax-Duffy antigen. ELISA tests showed that the antibody that was raised against Duffy antigens detected the presence of Duffy antigen in both subspecies and that the amount of this antigen on those erythrocyte membranes was similar. These results indicate that the greater resistance of B. taurus indicus to babesiosis cannot be explained by the absence or lower expression of Duffy antigen on RBC surfaces.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES