Using peptide aptamers to analyse the proteome

At the start of the 20th century, the 'rediscovery of Mendel' allowed the consideration of inheritance on a rational, scientific (albeit abstract) basis. During the period 1910-1920, T.H. Morgan and co-workers began to lay the groundwork for the practice of manipulative transmission genetics. This allowed researchers to collect mutants affected in a given genetic process, map those mutations to loci (genes), and further study the effects of combinations of those genes. The eventual linkage of genes to protein products was of course one of the early triumphs of molecular biology. Continuing improvements in transmission genetic methods, and their extension to more and more organisms, arguably accounted for the bulk of the increase in biological understanding during the latter half of the 20th century

Yeast Cbk1 and Mob2 Activate Daughter-Specific Genetic Programs to Induce Asymmetric Cell Fates

AbstractIn Saccharomyces cerevisiae, mothers and daughters have distinct fates. We show that Cbk1 kinase and its interacting protein Mob2 regulate this asymmetry by inducing daughter-specific genetic programs. Daughter-specific expression is due to Cbk1/Mob2-dependent activation and localization of the Ace2 transcription factor to the daughter nucleus. Ectopic localization of active Ace2 to mother nuclei is sufficient to activate daughter-specific genes in mothers. Eight genes are daughter-specific under the tested conditions, while two are daughter-specific only in saturated cultures. Some daughter-specific gene products contribute to cell separation by degrading the cell wall. These experiments define programs of gene expression specific to daughters and describe how those programs are controlled

GPCR receptor phosphorylation and endocytosis are not necessary to switch polarized growth between internal cues during pheromone response in S. cerevisiae

Chemotactic/chemotropic cells follow accurately the direction of gradients of regulatory molecules. Many G-protein-coupled receptors (GPCR) function as chemoattractant receptors to guide polarized responses. In “a” mating type yeast, the GPCR Ste2 senses the α-cell’s pheromone. Previously, phosphorylation and trafficking of this receptor have been implicated in the process of gradient sensing, where cells dynamically correct growth. Correction is often necessary since yeast have intrinsic polarity sites that interfere with a correct initial gradient decoding. We have recently showed that when actively dividing (not in G1) yeast are exposed to a uniform pheromone concentration, they initiate a pheromone-induced polarization next to the mother–daughter cytokinesis site. Then, they reorient their growth to the intrinsic polarity site. Here, to study if Ste2 phosphorylation and internalization are involved in this process, we generated receptor variants combining three types of mutated signals for the first time: phosphorylation, ubiquitylation and the NPFX1,2D Sla1-binding motif. We first characterized their effect on endocytosis and found that these processes regulate internalization in a more complex manner than previously shown. Interestingly, we showed that receptor phosphorylation can drive internalization independently of ubiquitylation and the NPFX1,2D motif. When tested in our assays, cells expressing either phosphorylation or endocytosis-deficient receptors were able to switch away from the cytokinesis site to find the intrinsic polarity site as efficiently as their WT counterparts. Thus, we conclude that these processes are not necessary for the reorientation of polarization.Fil: Vasen, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Dunayevich, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Constantinou, Andreas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin

Impact of upstream and downstream constraints on a signaling module's ultrasensitivity

Much work has been done on the study of the biochemical mechanisms that result in ultrasensitive behavior of simple biochemical modules. However, in a living cell, such modules are embedded in a bigger network that constrains the range of inputs that the module will receive as well as the range of the module’s outputs that network will be able to detect. Here, we studied how the effective ultrasensitivity of a modular system is affected by these restrictions. We use a simple setup to explore to what extent the dynamic range spanned by upstream and downstream components of an ultrasensitive module impact on the effective sensitivity of the system. Interestingly, we found for some ultrasensitive motifs that dynamic range limitations imposed by downstream components can produce effective sensitivities much larger than that of the original module when considered in isolation.Fil: Altszyler Lemcovich, Edgar Jaim. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ventura, Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Chernomoretz, Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentin

Messages Do Diffuse Faster Than Messengers: Reconciling disparate estimates of the morphogen Bicoid diffusion coefficient

The gradient of Bicoid (Bcd) is key for the establishment of the anterior-posterior axis in Drosophila embryos. The gradient properties are compatible with the SDD model in which Bcd is synthesized at the anterior pole and then diffuses into the embryo and is degraded with a characteristic time. Within this model, the Bcd diffusion coefficient is critical to set the timescale of gradient formation. This coefficient has been measured using two optical techniques, Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), obtaining estimates in which the FCS value is an order of magnitude larger than the FRAP one. This discrepancy raises the following questions: which estimate is ?correct?; what is the reason for the disparity; and can the SDD model explain Bcd gradient formation within the experimentally observed times. In this paper, we use a simple biophysical model in which Bcd diffuses and interacts with binding sites to show that both the FRAP and the FCS estimates may be correct and compatible with the observed timescale of gradient formation. The discrepancy arises from the fact that FCS and FRAP report on different effective (concentration dependent) diffusion coefficients, one of which describes the spreading rate of the individual Bcd molecules (the messengers) and the other one that of their concentration (the message). The latter is the one that is more relevant for the gradient establishment and is compatible with its formation within the experimentally observed times.Fil: Sigaut, Lorena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Pearson, John E.. Los Alamos National Laboratory;Fil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin

Pheromone-induced morphogenesis improves osmoadaptation capacity by activating the HOG MAPK pathway

Environmental and internal conditions expose cells to a multiplicity of stimuli whose consequences are difficult to predict. We investigate the response to mating pheromone of yeast cells adapted to high osmolarity. Events downstream of pheromone binding involve two mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades: the pheromone response (PR) and the cell wall integrity (CWI) response. Although the PR MAPK pathway shares components with a third MAPK pathway, the high osmolarity (HOG) response, each one is normally only activated by its cognate stimulus, a phenomenon called insulation. We found that in cells adapted to high osmolarity, PR activated the HOG pathway in a pheromone- and osmolarity-dependent manner. Activation of HOG by the PR was not due to loss of insulation, but rather a response to a reduction in internal osmolarity, which resulted from an increase in glycerol release caused by the PR. By analyzing single-cell time courses, we found that stimulation of HOG occurred in discrete bursts that coincided with the "shmooing" morphogenetic process. Activation required the polarisome, the CWI MAPK Slt2, and the aquaglyceroporin Fps1. HOG activation resulted in high glycerol turnover, which improved adaptability to rapid changes in osmolarity. Our work shows how a differentiation signal can recruit a second, unrelated sensory pathway to fine-tune yeast response in a complex environment.Fil: Baltanas, Rodrigo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas . Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Bush, Alan. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas . Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Couto, Alicia Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; ArgentinaFil: Durrieu, Lucía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas . Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Hohmann, Stefan. University of Gothenburg. Department of Cell and Molecular Biology; SueciaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas . Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin

Cell-to-cell variability in the yeast pheromone response: Cytoplasmic microtubule function stabilizes signal generation and promotes accurate fate choice

In a companion paper, we carried out a high-throughput screen to identify genes that suppressed cell-to-cell variability in signaling in yeast. Two genes affected cytoplasmic microtubules that can connect the nucleus to a signaling site on the membrane. Here, we show that microtubule perturbations that affected polymerization and depolymerization, membrane attachment, and force generation increased variability. For some perturbations, "outlier" cells drove the increased variability. Bypass experiments that activated the PRS ectopically at downstream points indicated that microtubule-dependent processes might stabilize the membrane-recruited scaffold protein Ste5. The variability caused by microtubule perturbations required the MAP kinase Fus3. Microtubule perturbations hindered stable scaffold formation and decreased the accuracy of a polarity-dependent fate choice. Our experiments suggest that membrane-attached microtubules stabilize signaling by scaffold-bound Fus3, and are consistent with a model in which signaling irregularities from changes in microtubule function are amplified by cross-stimulatory feedbacks among PRS proteins. The fact that microtubule perturbations also cause aberrant fate and polarity decisions during embryonic development and cancer initiation suggests that similar variation-reducing processes might also operate in metazoans

Compartmentalization of a Bistable Switch Enables Memory to Cross a Feedback-Driven Transition

SummaryCells make accurate decisions in the face of molecular noise and environmental fluctuations by relying not only on present pathway activity, but also on their memory of past signaling dynamics. Once a decision is made, cellular transitions are often rapid and switch-like due to positive feedback loops in the regulatory network. While positive feedback loops are good at promoting switch-like transitions, they are not expected to retain information to inform subsequent decisions. However, this expectation is based on our current understanding of network motifs that accounts for temporal, but not spatial, dynamics. Here, we show how spatial organization of the feedback-driven yeast G1/S switch enables the transmission of memory of past pheromone exposure across this transition. We expect this to be one of many examples where the exquisite spatial organization of the eukaryotic cell enables previously well-characterized network motifs to perform new and unexpected signal processing functions

A new tool to sense pH changes at the neuromuscular junction synaptic cleft

Synaptic transmission triggers transient acidification of the synaptic cleft. Recently, it has been shown that pH affects the opening of postsynaptic channels and therefore the production of tools that allow to study these behaviors should result of paramount value. We fused α-bungarotoxin, a neurotoxin derived from the snake Bungarus multicinctus that binds irreversibly to the acetylcholine receptor extracellular domain, to the pH sensitive GFP Super Ecliptic pHluorin, and efficiently expressed it in Pichia pastoris. This sensor allows synaptic changes in pH to be measured without the need of incorporating transgenes into animal cells. Here, we show that incubation of the mouse levator auris muscle with a solution containing this recombinant protein is enough to fluorescently label the endplate post synaptic membrane. Furthermore, we could physiologically alter and measure post synaptic pH by evaluating changes in the fluorescent signal of pHluorin molecules bound to acetylcholine receptors. In fact, using this tool we were able to detect a drop in 0.01 to 0.05 pH units in the vicinity of the acetylcholine receptors following vesicle exocytosis triggered by nerve electrical stimulation. Further experiments will allow to learn the precise changes in pH during and after synaptic activation.Fil: Blaustein Kappelmacher, Matias. Universidad de Buenos Aires; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Wirth, Sonia Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada; ArgentinaFil: Saldaña, G.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Piantanida, Ana Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Bogetti, Maria Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Martin, Maria Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Uchitel, Osvaldo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin

Dispersión de contaminantes y zonas de afectación en un incidente químico para la planificación y respuesta

Los patrones espaciales y las variaciones en el tiempo de las concentraciones de sustancias peligrosas, junto a los efectos potenciales sobre la población subyacente, son necesarios para ayudar a la planificación y respuesta en una emergencia química. A tal fin, existen modelos que predicen el transporte y la dispersión de sustancias peligrosas y otros que estiman los efectos potenciales experimentados por la población expuesta. En conjunto, constituyen una poderosa herramienta para estimar las regiones vulnerables y evaluar los impactos potenciales en la población afectada. El desarrollo de metodologías y de modelos, de aplicación directa al contexto en que vivimos, permiten acceder a una representación más clara del escenario de riesgo y consecuentemente disponer de las herramientas adecuadas para una respuesta óptima. A través del reciente desarrollo del modelo de exposición DDC (Damage Differential Coupling) se ha logrado optimizar, cuali y cuantitativamente, la estimación de la población afectada por una nube tóxica debido a su capacidad para acoplarse a cualquier modelo atmosférico de dispersión de contaminantes que disponga de una salida de datos en forma temporal. De este modo, DDC analiza los diferentes perfiles de concentración (salida del modelo de transporte) y los asocia con alguna concentración de referencia de alerta (LOC) para así identificar las áreas de riesgo. En este trabajo se presenta el análisis de un escenario de desastre en Chicago-USA, a través del acoplamiento de DDC con dos modelos de transporte de diferente complejidad, dejando en manifiesto la estrecha relación que existe entre un resultado representativo y el tiempo de ejecución de los modelos. Del mismo modo, queda en evidencia la necesidad de contar con la evolución temporal de la nube tóxica y de las regiones de afectación para la adecuada toma decisiones en la planificación y respuesta a la emergencia.Laboratorio de Capa Límite y Fluidodinámica AmbientalGrupo Fluidodinámica Computaciona