Estudo de 30 casos de histoplasmose no Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil

Thirty cases of histoplasmosis observed at the University Hospital of the Federal University of Mato Grosso do Sul (HU-UFMS) from January 1998 to December 2005 are reported. Most (83.3%) of the patients were men, average 33.4 years old, 63.3% of them were born and living in Mato Grosso do Sul and 83.3% presented AIDS as an underlying disease. In almost all cases (96.7%) the disease occurred in its disseminated form and the most frequent clinical manifestations were: fever (83.3%), weight loss (70.0%), cough (63.3%), hepatomegaly and splenomegaly (40.0%), and lymph node enlargement (36.7%). The laboratory diagnosis was obtained in 29 patients by isolation of Histoplasma capsulatum from various clinical specimens cultivated in Sabouraud dextrose and brain heart infusion agar and in 16 patients the fungus was observed by direct microscopy of Giemsa-stained smears. The observed mortality was 40%. This is the first report in the literature of the occurrence of histoplasmosis in Mato Grosso do Sul State.Foram estudados 30 casos de histoplasmose observados no estado de Mato Grosso do Sul - HU-UFMS, no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2005. Os pacientes eram, na maioria, homens (83,3%) jovens (média de 33,4 anos de idade), naturais e procedentes de Mato Grosso do Sul (63,3%) e tinham AIDS como principal doença subjacente (83,3%). Houve predomínio da forma disseminada (96,7%) e as manifestações clínicas mais freqüentes foram: febre (83,3%), emagrecimento (70,0%) tosse (63,3%), hepatoesplenomegalia (40,0%) e linfonodomegalia (36,7%). O diagnóstico laboratorial foi obtido por exame microscópio direto de esfregaços corados pela técnica de Giemsa, em 16 pacientes, e isolamento de H. capsulatum em cultivo nos meios de agar Sabouraud dextrose e agar infusão de cérebro e coração, de materiais diversos, em 29 pacientes. A letalidade observada foi de 40%. O trabalho apresenta, pela primeira vez na literatura, a ocorrência de histoplasmose-doença no Estado de Mato Grosso do Sul

Virulence potential of filamentous fungi isolated from poultry barns in Cascavel, Paraná, Brazil

Opportunistic fungi are those that normally would not cause diseases in otherwise healthy people, but are able to cause problems under some circumstances, and for this they need to possess a certain virulence potential. The objective of this study was to identify samples of filamentous fungi isolated from poultry barns in Cascavel, Paraná, and also to evaluate their virulence potential by assessing proteinase production, hemolytic activity, urease production, and growth rate at 37 ºC. We have evaluated the following samples: Acremonium hyalinulum (1 sample), Aspergillus sp. (12), Beauveria bassiana (1), Curvularia brachyspora (1), Paecilomyces variotti (1), and Penicillium sp. (2). Out of the 18 samples analyzed, 44.4% showed proteolytic activity using albumin as the substrate versus 66.7% when using casein; 66.7% showed hemolytic activity, 83.3% were positive for urea, and 88.9% grew at a temperature of 37 ºC. The results demonstrated that the majority of the isolates expressed virulence factors. Therefore, these isolates have the potential to harm human hosts, such as those working at poultry barns, especially predisposed or susceptible individuals.Fungos oportunistas são aqueles que normalmente não causariam doenças em pessoas saudáveis, mas eles são capazes de causar problemas sob certas circunstâncias e, para isso, eles necessitam possuir algum potencial de virulência. O objetivo deste trabalho foi identificar amostras de fungos filamentosos isolados de granjas de aves em Cascavel, Paraná, e também avaliar o seu potencial de virulência, verificando a produção de proteinase, atividade hemolítica, produção de urease e crescimento a 37 ºC. Foram avaliados Acremonium hyalinulum (01), Aspergillus sp (12), Beauveria bassiana (01), Curvularia brachyspora (01), Paecylomices variotti (01) e Penicillium sp (02). Das 18 amostras, 44,4% apresentaram atividade proteolítica usando como substrato a albumina e 66,7% com caseína; 66,7% demonstraram atividade hemolítica, 83,3% foram uréia positivas e 88,9% cresceram em temperatura de 37 ºC. Os resultados demonstram que a maioria dos isolados expressaram fatores de virulência e, portanto, têm potencial para causar danos a hospedeiros humanos como os trabalhadores dos aviários, sobretudo em indivíduos predispostos ou suscetíveis

Validation of a PCR multiplex assay for detection and identification of Candida spp. in bloodstream infections of critically ill pediatric patients

A ocorrência de candidemias em pacientes internados em unidades de cuidados intensivos é um grave problema por estar relacionada a elevadas taxas de mortalidade. Sinais e sintomas de infecção hematogênica causada por Candida sp. são inespecíficos, dificultando o diagnóstico e representando um desafio para o desenvolvimento de métodos diagnósticos que identifiquem precocemente o agente em amostras clínicas. As metodologias tradicionais (hemocultura e identificação fenotípica) e sorológicas (detecção de beta-D-glucana, manana e anticorpos anti-manana) apresentam limitações de sensibilidade e especificidade, sendo os métodos moleculares uma alternativa para o diagnóstico dessas infecções. Neste trabalho foi desenvolvida uma técnica de nested PCR multiplex capaz de identificar sete espécies de Candida (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. lusitaniae e C. pelliculosa) diretamente em amostras sanguíneas de pacientes com elevado risco de desenvolver candidemias. Na primeira etapa de amplificação foram utilizados primers universais para fungos (ITS1 e ITS4); e na segunda, os primers espécie-específicos foram distribuídos em dois sistemas de amplificação, a saber: um com primers para C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. lusitaniae; e outro com primers para C. parapsilosis, C. krusei e C. pelliculosa. A nested PCR multiplex foi capaz de detectar cerca de 4UFC/mL das espécies envolvidas no estudo, não apresentando reatividade cruzada quando avaliada com amostras de DNA de outros fungos e bactérias envolvidos em episódios de infecção hematogênica. Foram analisadas 55 amostras obtidas de pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos do Instituto da Criança do HC-FMUSP e do Hospital de Base da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - UNESP, com idades variando de seis dias a 16 anos, apresentando Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica e/ou dois ou mais fatores de risco para infecção fúngica. Também foi avaliado no estudo um grupo controle, composto por 28 crianças sem risco de desenvolver fungemias, para verificação da ocorrência de possíveis reações inespecíficas pela técnica molecular. As hemoculturas foram positivas em oito pacientes (14,8%), tendo sido identificadas cinco C. albicans, uma C. tropicalis, uma C. parapsilosis e uma C. krusei. Por outro lado, a técnica de nested PCR multiplex detectou DNA de Candida em 13 pacientes (23,6%), tendo havido concordância na identificação das espécies em 100% dos casos. Entretanto, não foi observada discordância estatisticamente significativa (p=0,063) entre as duas metodologias. Dos cinco pacientes com hemoculturas negativas, a técnica molecular foi capaz de detectar dupla candidemia em três casos, identificando nessas amostras C. tropicalis e C. parapsilosis simultaneamente. Nos cinco casos em que apenas a técnica de PCR foi positiva, as amostras amplificadas foram sequenciadas, apresentando similaridades de 99 a 100%, quando comparadas às sequencias de cepas de Candida depositadas no GenBank. O tempo para execução da técnica e liberação de resultados foi de aproximadamente 24 horas. O custo relativo aos procedimentos realizados para execução da PCR foi calculado e comparado ao custo dos procedimentos executados nas hemoculturas, tendo sido mais baixo. Os resultados demonstram que a nested PCR multiplex é técnica alternativa para a detecção e identificação de espécies de Candida em pacientes com risco de desenvolver candidemias, apresentando limiar de detecção adequado e capacidade de identificar mais de uma espécie de Candida simultaneamente em amostras clínicas. A técnica é ainda capaz de permitir a liberação de resultados em menor tempo, além de apresentar menor custo, quando comparada à metodologia convencional de cultivoThe incidence of candidemia among intensive care unit patients is associated with high mortality rates. The non-specific nature of the signs and symptoms of this infection difficult the diagnosis. Development of methods that allow early identification of the agent in clinical samples still represents a challenge. Classical methodologies (blood cultures and phenotypic identification) and serological tests (beta-D-glucan and mannan detection; anti-mannan antibodies) to diagnose candidemia lack sensitivity and specificity. Molecular methods are an alternative approach to the diagnosis of candidemia. In this work we developed a nested PCR multiplex assay able to identify seven Candida species (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. lusitaniae and C. pelliculosa) directly in blood samples of patients at high risk of candidemia. In the first stage of amplification universal fungal primers (ITS1 and ITS4) were used and in the second stage, the species-specific primers were divided into two amplification systems, one with primers for C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C. lusitaniae, and another with primers for C. parapsilosis, C. krusei and C. pelliculosa. The multiplex nested PCR was able to detect approximately 4 CFU/mL of the seven Candida species, and showed no cross reactivity when evaluated with samples of DNA from other fungi and bacteria causing hematogenous infection episodes. We analyzed 55 samples obtained from patients admitted to pediatric intensive care units of the Instituto da Criança do HCFMUSP and Hospital de Base of Medical School from São José do Rio Preto - UNESP, with ages ranging from six days to 16 years, presenting the Systemic Inflammatory Response Syndrome and/or two or more risk factors of fungal infection. A control group of 28 children without risk of fungemia, to check for occurrence of nonspecific reactions in the molecular technique, was also evaluated. Blood cultures were positive in eight patients (14.8%), five were identified as C. albicans, and the remaining as C. tropicalis, C. parapsilosis and C. krusei. The nested multiplex PCR assay detected Candida DNA in 13 patients (23.6%), and there was concordance in species identification in 100% of the cases. In five patients with negative blood cultures, the molecular technique was capable of detecting dual candidemia in three patients\' samples, identifying C. tropicalis and C. parapsilosis simultaneously. However, there was no statistically significant disagreement (p = 0.063) between the two methods. In these five cases for whom only the PCR was positive, the amplified samples were sequenced, showing similarities from 99 to 100% when compared with sequences of Candida strains deposited in GenBank. Time for execution of the technique and release of results was about 24 hours. The cost of PCR assay was compared with the cost of the conventional blood culture tests and was lower. In conclusion, we demonstrated that the nested PCR multiplex developed in our laboratory is an alternative technique for the detection and identification of Candida species in patients at risk of candidemia, showing appropriate detection threshold and the ability to identify simultaneously more than one Candida species in clinical samples. The technique is also rapid, giving results in 24 h and exhibiting lower cost when compared with the conventional culture methodolog

Mapping of epitopes for development of vaccines from Histoplasma capsulatum M antigen.

Histoplasma capsulatum é um fungo termodimórfico, encontrado de forma ubíqua na natureza. As regiões endêmicas incluem os vales do rio Ohio e Mississipi (EUA), a América Central e a América do Sul; no Brasil casos da doença e microepidemias vêm sendo descritos com maior frequência na região sudeste. O antígeno M é uma glicoproteína encontrada na parede do fungo e induz resposta imune tanto na fase aguda quanto na fase crônica da doença. Levando em consideração que a caracterização do antígeno M como candidato a vacina ainda não foi realizada é de grande importância a avaliação e identificação de epítopos que possam gerar novas ferramentas para utilização na prevenção da histoplasmose. Neste trabalho foram sintetizados peptídeos, a partir de análise in silico da sequência do antígeno M, com capacidade teórica de se ligar e serem apresentados por moléculas de MHC de classe II de camundongos C57BL/6. Das sequências geradas foram escolhidas e sintetizadas 12, entre as quais, três (peptídeo 6, 10 e 12) apresentaram resultados promissores na imunização profilática de camundongos contra a histoplasmose, diminuindo a carga fúngica nos pulmões e produzindo citocinas com perfil de resposta imune do tipo Th1 (peptídeo 12) e Th17 (peptídeo 10 e 12) em animais desafiados com inóculo subletal do fungo. Também foram identificados 9 peptídeos de H. capsulatum (naturalmente processados e apresentados), por espectrometria de massa, a partir de macrófagos infectados com leveduras, submetidos a imunoprecipitação para isolamento dos complexos MHC-II-peptídeo. Concluímos que metodologias de predição in silico são importantes e de grande utilidade para mapeamento de sequências peptídicas provenientes de proteínas imunogênicas, visto que, três peptídeos testados apresentaram resultados promissores na imunização de animais posteriormente desafiados com os fungos; em relação à metodologia de imunoproteômica para identificação de peptídeos apresentados por células APCs após fagocitose do fungo, acreditamos que essa técnica é promissora, pois as sequências peptídicas identificadas foram naturalmente processadas e apresentadas, tendo possibilidade de serem capazes de estimular o TCR e desencadear resposta imune de células T, sendo necessária confirmação com testes in vitro e in vivo.Histoplasma capsulatum is a thermodymorphic fungus, found ubiquitously in nature. Endemic regions include the valleys of the Ohio River and Mississippi (USA), Central America and South America; in Brazil disease cases and microepidemias have been described more frequently in the southeast region. M antigen is a glycoprotein found in the wall of the fungus and induces immune response in both acute and chronic phases of the disease. The characterization of the M antigen as vaccine candidate has not yet been performed and it is of great importance the evaluation and identification of epitopes that can generate new tools for use in the prevention of histoplasmosis. In this work, peptides from in silico analysis of protein antigen M sequence, with the theoretical ability to bind and be presented by MHC class II molecules of C57BL/6 mice, were synthesized. Twelve of the sequences generated were selected and synthesized, among which three (peptides 6, 10 and 12) showed promising results in the prophylactic immunization of mice against histoplasmosis, reducing the fungal load in the lungs and producing cytokines with Th1 response profile (peptide 12) and Th17 response profile (peptide 10 and 12) in animals challenged with sublethal inoculum of the fungus. Also, nine peptide sequences of H. capsulatum (naturally processed and presented) were identified by mass spectrometry from yeast-infected macrophages submitted to immunoprecipitation to isolate the MHC-II peptide complexes. We conclude that in silico prediction methodologies are important and useful for the peptide sequences mapping from immunogenic proteins, since three peptides tested showed promising results in the immunization of animals later challenged with fungi; in relation to the immunoproteomics approach for the identification of peptides presented by APC cells after phagocytosis of the fungus, we believe that this technique is promising because the identified peptide sequences were naturally processed and presented, being able to stimulate the TCR and trigger T cells immune response, confirming with in vitro and in vivo tests is still required

Virulence potential of filamentous fungi isolated from poultry barns in Cascavel, Paraná, Brazil

Opportunistic fungi are those that normally would not cause diseases in otherwise healthy people, but are able to cause problems under some circumstances, and for this they need to possess a certain virulence potential. The objective of this study was to identify samples of filamentous fungi isolated from poultry barns in Cascavel, Paraná, and also to evaluate their virulence potential by assessing proteinase production, hemolytic activity, urease production, and growth rate at 37 ºC. We have evaluated the following samples: Acremonium hyalinulum (1 sample), Aspergillus sp. (12), Beauveria bassiana (1), Curvularia brachyspora (1), Paecilomyces variotti (1), and Penicillium sp. (2). Out of the 18 samples analyzed, 44.4% showed proteolytic activity using albumin as the substrate versus 66.7% when using casein; 66.7% showed hemolytic activity, 83.3% were positive for urea, and 88.9% grew at a temperature of 37 ºC. The results demonstrated that the majority of the isolates expressed virulence factors. Therefore, these isolates have the potential to harm human hosts, such as those working at poultry barns, especially predisposed or susceptible individuals.Fungos oportunistas são aqueles que normalmente não causariam doenças em pessoas saudáveis, mas eles são capazes de causar problemas sob certas circunstâncias e, para isso, eles necessitam possuir algum potencial de virulência. O objetivo deste trabalho foi identificar amostras de fungos filamentosos isolados de granjas de aves em Cascavel, Paraná, e também avaliar o seu potencial de virulência, verificando a produção de proteinase, atividade hemolítica, produção de urease e crescimento a 37 ºC. Foram avaliados Acremonium hyalinulum (01), Aspergillus sp (12), Beauveria bassiana (01), Curvularia brachyspora (01), Paecylomices variotti (01) e Penicillium sp (02). Das 18 amostras, 44,4% apresentaram atividade proteolítica usando como substrato a albumina e 66,7% com caseína; 66,7% demonstraram atividade hemolítica, 83,3% foram uréia positivas e 88,9% cresceram em temperatura de 37 ºC. Os resultados demonstram que a maioria dos isolados expressaram fatores de virulência e, portanto, têm potencial para causar danos a hospedeiros humanos como os trabalhadores dos aviários, sobretudo em indivíduos predispostos ou suscetíveis

A multiplex nested PCR for the detection and identification of Candida species in blood samples of critically ill paediatric patients

Abstract Background Nosocomial candidaemia is associated with high mortality rates in critically ill paediatric patients; thus, the early detection and identification of the infectious agent is crucial for successful medical intervention. The PCR-based techniques have significantly increased the detection of Candida species in bloodstream infections. In this study, a multiplex nested PCR approach was developed for candidaemia detection in neonatal and paediatric intensive care patients. Methods DNA samples from the blood of 54 neonates and children hospitalised in intensive care units with suspected candidaemia were evaluated by multiplex nested PCR with specific primers designed to identify seven Candida species, and the results were compared with those obtained from blood cultures. Results The multiplex nested PCR had a detection limit of four Candida genomes/mL of blood for all Candida species. Blood cultures were positive in 14.8% of patients, whereas the multiplex nested PCR was positive in 24.0% of patients, including all culture-positive patients. The results obtained with the molecular technique were available within 24 hours, and the assay was able to identify Candida species with 100% of concordance with blood cultures. Additionally, the multiplex nested PCR detected dual candidaemia in three patients. Conclusions Our proposed PCR method may represent an effective tool for the detection and identification of Candida species in the context of candidaemia diagnosis in children, showing highly sensitive detection and the ability to identify the major species involved in this infection