Invecchiamento ovocitario umano: parametri strutturali ed ultrastrutturali

XXVI Ciclo di Dottorato in “Biotecnologie della Riproduzione Umana” – Università “Sapienza” di Roma. Riassunto 3° anno (anno accademico 2012/2013) Dottoranda: Claudia Boninsegna Titolo del progetto di ricerca: “Invecchiamento ovocitario umano: parametri strutturali ed ultrastrutturali” L’infertilità è definita come l’incapacità di una coppia di concepire dopo un anno o più di rapporti sessuali regolari non protetti. Negli ultimi decenni si è riscontrato un notevole aumento dei tassi di infertilità, dovuto principalmente al ritardo nella programmazione della gravidanza. L’esistenza di una relazione inversa tra età e fertilità femminile è nota da tempo ed è determinata dalla graduale diminuzione che si verifica con l’età sia nella quantità che nella qualità dei gameti femminili, gli ovociti. Lo scopo di questo lavoro è l’osservazione approfondita, tramite microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, dei tratti morfologici che caratterizzando l’invecchiamento ovocitario, sia nel processo fisiologico dell’invecchiamento riproduttivo (reproductive aging, RA), sia nel corso dell’invecchiamento in vitro (in vitro aging, IvA). Lo studio è stato condotto su 61 ovociti maturi (MII) soprannumerari donati alla ricerca, previa firma di un consenso informato e secondo le leggi vigenti, da 23 pazienti che si sono sottoposte a trattamenti di fecondazione assistita (IVF o ICSI) nel periodo compreso tra Ottobre 2007 e Luglio 2013. I trattamenti sono stati eseguiti presso la UOC OGC03 - Infertilità e FIVET (Prof. C. Aragona) del DAI (Dipartimento di Attività Integrata) di Ginecologia e Ostetricia, Perinatologia e Puericultura (Prof Pierluigi Benedetti Panici) dell’Azienda Policlinico Umberto I, Università “Sapienza” di Roma (DU -Dipartimento Universitario- di Scienze Ginecologico-ostetriche e Scienze Urologiche, Prof Vincenzo Gentile) Gli ovociti sono stati suddivisi in due gruppi in base all’età delle pazienti: A (età inferiore a 35 anni, 25 ovociti) e B (età uguale o superiore ai 35 anni, 36 ovociti). Un totale di 31 ovociti (13 ovociti nel gruppo A e 18 del gruppo B) sono stati fissati poco dopo il pick up (tempo 0); i rimanenti 30 (12 nel gruppo A e 18 del gruppo B) sono stati fissati dopo 24 ore di coltura. La successiva analisi di microscopia ottica ed elettronica è stata condotta presso la UO Microscopia elettronica (Prof. Giuseppe Familiari), sezione di Anatomia Umana (Prof. E. Gaudio) del Dipartimento di Scienze Anatomiche, Istologiche, Medico Legali e dell’Apparato Locomotore (Prof. Elio Ziparo) dell’Università “Sapienza” di Roma. Tale analisi è stata condotta in collaborazione con la sezione di Anatomia (Prof. Guido Macchiarelli) del Dipartimento di Scienze della Salute dell’Università degli studi dell’Aquila. I gruppi in esame erano perciò i seguenti: • gruppo <35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età inferiore a 35 anni • gruppo <35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età inferiore a 35 anni • gruppo ≥35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età uguale o superiore a 35 anni • gruppo ≥35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età uguale o superiore a 35 anni Per la valutazione della preservazione strutturale (microscopia ottica) e ultrastrutturale (microscopia elettronica a trasmissione) degli ovociti sono stati presi in considerazione diversi parametri morfologici; l’analisi statistica si è concentrata su 5 di essi - spessore della zona pellucida (zona pellucida thickness, ZPt) - numero di granuli corticali (cortical granules, CG) per 10 um di superficie lineare - numero di microvilli (Mv) per 10 um di superficie lineare - densità degli aggregati di mitocondri e tubuli di reticolo endoplasmatico liscio (mitochondria-smooth endoplasmic reticulum aggregates, M-SER) per 10 um2 di area citoplasmatica - densità dei complessi di mitocondri e vescicole di reticolo endoplasmatico liscio (mitochondria-vesicle complex, MVC) per 10 um2 di area citoplasmatica Gli ovociti del gruppo <35 mostrano le caratteristiche ultrastrutturali tipiche degli ovociti MII ideali: MVC piccole e scarsamente rappresentate (densità 0,35±0,26 per 10um2) ed aggregati M-SER ben rappresentati (densità 2,89±0,68 per 10um2), una quantità adeguata di CGs e di Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 18,32±1,93um. Negli ovociti del gruppo <35c si osserva un aumento della densità di MVC (1,31±0,36 per 10um2) ed una contemporanea riduzione dei complessi M-SER (1,80±0,35 per 10um2) e, in misura più lieve, dei CG e dei Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 18,27±1,74um. Neli ovociti del gruppo ≥35 i MCV sono presenti in numero maggiore (densità 2,05±0,48 per 10um2), i complessi M-SER sono scarsi (0,97±0,28 per 10um2) e si osserva una ulteriore riduzione dei CG e dei Mv (rispettivamente 7,45±1,37 e 6±1 per 10um). Lo spessore medio della ZP era 21,73±1,79um. Negli ovociti del gruppo ≥35c si osserva un aumento notevole della densità dei MVC (3,19±0,40 per 10um2) e una marcata diminuzione dei complessi M-SER (0,57±0,31 per 10um2). Si osserva anche una riduzione della quantità di CG e di Mv (rispettivamente 2,55±1,37 e 4,73±1,13). Lo spessore medio della ZP era 21,55±1,57um. Rispetto agli ovociti di “controllo”, appartenenti al primo gruppo (<35), le variazioni numeriche mostrano dunque un andamento graduale, essendo minime nel gruppo <35c, più evidenti nel gruppo ≥35 e molto accentuate nel gruppo ≥35c. In conclusione, gli ovociti invecchiati in vitro e quelli invecchiati in vivo condividono molte caratteristiche ultrastrutturali tipiche che possono essere considerate markers morfologici di invecchiamento. Inoltre i dati presentati in questo lavoro rivelano che gli ovociti di donne giovani sembrano meno sensibili all’invecchiamento in vitro rispetto a quelli di donne in età avanzata, già soggetti a invecchiamento riproduttivo. Questi ultimi ovociti sembrano subire un invecchiamento in vitro prematuro, che potrebbe spiegare la loro ridotta finestra di fecondazione e la minore competenza di sviluppo

MORPHOLOGICAL AND MATHEMATICAL ANALYSIS OF ICSI EMBRYO SHAPES AND DEVELOPMENTAL FATE: PRELIMINARY OBSERVATIONS

Main and most common methods of embryo analysis and morphological classification currently used in ART medical practice evaluate a multiplicity of morphological parameters, e.g. blastomeres number and symmetry, internal structures homogeneity, presence of corpuscles, cytoplasmatic features and characterization of embryo external shape (regularity, thickness and thickness variation of zona pellucida, ZP). Growing evidences are suggesting that cell shape should be considered as the most critical determinant of embryo competence, therefore quantitative shape descriptors could provide an insight on complex systems being observed. In this study it is presented an original method for calculating a shape form factor (algorithm) linked to local morphological variability of embryo ZP, called Local ZP Variation (LZPV), instead of its macroscopic characteristics. This method is based on harmonic analysis techniques application in frequency-domain representation of ZP inner and outer boundaries, to verify whether harmonic measures could be observationally associated to better results in terms of pregnancy outcome. Preliminary observations show that our method, whether confirmed in a larger series of patients for its validity and reproducibility, may represent a valuable tool for specialists to distinguish embryos of good quality with higher ability to implant and reach term pregnancy

Ultrastructural markers of quality are impaired in human metaphase II aged oocytes: a comparison between reproductive and in vitro aging

PURPOSE: Childbearing delay contributes to the increase of subfertile couples that require assisted reproductive technology (ART). Subfertility relates with reproductive aging (RA). In vitro aging (IvA) (due to extended culture) may also impair oocyte competence. Aims of this study were to evaluate and compare the oocyte ultrastructure after RA and IvA. METHODS: Cumulus-oocyte complexes (COCs) (n=68), with metaphase II oocyte and expanded cumulus, from consenting patients (<35years old and ≥35years old, n=36), were selected by phase contrast microscopy and fixed at pick up, or after 24h culture. COCs (n=44) were studied by light and qualitative/morphometric transmission electron microscopy. Two-way ANOVA, with age and culture as grouping factors, was applied for statistical analysis (p<0.05). Metaphase II cumulus-free oocytes (n=24) were selected for confocal microscopy observations. RESULTS: Significant decrease of mitochondria-smooth endoplasmic reticulum aggregates, increase of mitochondria-vesicle complexes size and amount, decrease of cortical granules and microvilli, and alterations of the spindle structure characterized both RA and IvA oocytes. These changes were significantly more evident in the RA oocytes submitted to IvA. RA oocytes also showed changes of the zona pellucida and occurrence of vacuoles after culture. Cumuli appeared re-compacted after culture, irrespective of the age of the patients. CONCLUSIONS: These data demonstrated that aging is related to decay of oocyte ultrastructural quality, and that oocytes from elder women are more sensitive to prolonged culture (IvA) than the oocytes from younger women. These morphological results should be considered when applying ART in aged patients, rescue ICSI, or artificial oocyte activation

A geroscience approach for Parkinson's disease: Conceptual framework and design of PROPAG-AGEING project

Advanced age is the major risk factor for idiopathic Parkinson's disease (PD), but to date the biological relationship between PD and ageing remains elusive. Here we describe the rationale and the design of the H2020 funded project "PROPAG-AGEING", whose aim is to characterize the contribution of the ageing process to PD development. We summarize current evidences that support the existence of a continuum between ageing and PD and justify the use of a Geroscience approach to study PD. We focus in particular on the role of inflammaging, the chronic, low-grade inflammation characteristic of elderly physiology, which can propagate and transmit both locally and systemically. We then describe PROPAG-AGEING design, which is based on the multi-omic characterization of peripheral samples from clinically characterized drug-naive and advanced PD, PD discordant twins, healthy controls and "super-controls", i.e. centenarians, who never showed clinical signs of motor disability, and their offspring. Omic results are then validated in a large number of samples, including in vitro models of dopaminergic neurons and healthy siblings of PD patients, who are at higher risk of developing PD, with the final aim of identifying the molecular perturbations that can deviate the trajectories of healthy ageing towards PD development