Cytosolic 5'-Nucleotidase II Interacts with the Leucin Rich Repeat of NLR Family Member Ipaf

IMP/GMP preferring cytosolic 5'-nucleotidase II (cN-II) is a bifunctional enzyme whose activities and expression play crucial roles in nucleotide pool maintenance, nucleotide-dependent pathways and programmed cell death. Alignment of primary amino acid sequences of cN-II from human and other organisms show a strong conservation throughout the entire vertebrata taxon suggesting a fundamental role in eukaryotic cells. With the aim to investigate the potential role of this homology in protein-protein interactions, a two hybrid system screening of cN-II interactors was performed in S. cerevisiae. Among the X positive hits, the Leucin Rich Repeat (LRR) domain of Ipaf was found to interact with cN-II. Recombinant Ipaf isoform B (lacking the Nucleotide Binding Domain) was used in an in vitro affinity chromatography assay confirming the interaction obtained in the screening. Moreover, co-immunoprecipitation with proteins from wild type Human Embryonic Kidney 293 T cells demonstrated that endogenous cN-II co-immunoprecipitated both with wild type Ipaf and its LRR domain after transfection with corresponding expression vectors, but not with Ipaf lacking the LRR domain. These results suggest that the interaction takes place through the LRR domain of Ipaf. In addition, a proximity ligation assay was performed in A549 lung carcinoma cells and in MDA-MB-231 breast cancer cells and showed a positive cytosolic signal, confirming that this interaction occurs in human cells. This is the first report of a protein-protein interaction involving cN-II, suggesting either novel functions or an additional level of regulation of this complex enzym

Cytosolic 5'-Nucleotidase II Is a Sensor of Energy Charge and Oxidative Stress: A Possible Function as Metabolic Regulator

Cytosolic 5'-nucleotidase II (NT5C2) is a highly regulated enzyme involved in the maintenance of intracellular purine and the pyrimidine compound pool. It dephosphorylates mainly IMP and GMP but is also active on AMP. This enzyme is highly expressed in tumors, and its activity correlates with a high rate of proliferation. In this paper, we show that the recombinant purified NT5C2, in the presence of a physiological concentration of the inhibitor inorganic phosphate, is very sensitive to changes in the adenylate energy charge, especially from 0.4 to 0.9. The enzyme appears to be very sensitive to pro-oxidant conditions; in this regard, the possible involvement of a disulphide bridge (C175-C547) was investigated by using a C547A mutant NT5C2. Two cultured cell models were used to further assess the sensitivity of the enzyme to oxidative stress conditions. NT5C2, differently from other enzyme activities, was inactivated and not rescued by dithiothreitol in a astrocytoma cell line (ADF) incubated with hydrogen peroxide. The incubation of a human lung carcinoma cell line (A549) with 2-deoxyglucose lowered the cell energy charge and impaired the interaction of NT5C2 with the ice protease-activating factor (IPAF), a protein involved in innate immunity and inflammation

Structural and functional studies of cytosolic 5’-nucleotidase II (cN-II)

La 5’-nucleotidasi citosolica II (cN-II) è una proteina enzimatica citosolica dalla doppia natura catalitica che fosfoidrolizza i nucleosidi monofosfati purinici con particolare affinità per IMP e GMP. cN-II contribuisce a ripristinarne i livelli catalizzando la formazione di un nuovo nucleoside monofosfato in presenza di un nucleoside accettore a cui viene trasferita la molecola di fosfato che durante la catalisi di fosfoidrolizzazione rimane legata alla forma intermedia dell’ enzima. Per queste ed altre sue proprietà, discusse in abbondanza nel mio lavoro di tesi, nel corso degli anni, cN-II ha attirato l’attenzione della comunità scientifica che ha affrontato lo studio della stessa da numerosi punti di vista quali la biochimica, la cristallografia, la biologia molecolare, l’oncologia, la farmacologia e la genetica. Ad oggi si ha una discreta conoscenza delle proprietà catalitiche, della distribuzione tissutale e dell’abbondanza relativa, nonchè dei principali ruoli fisiologici che caratterizzano cN-II. L’enzima, infatti, appare espresso in maniera ubiquitaria sempre a basse concentrazioni, ad eccezione di quei tessuti altamente rigenerativi e di cellule maligne. Ne è stato accertato, anche, il ruolo chiave nel mantenere l’omeostasi di IMP, precursore di tutti i nucleotidi purinici. Inoltre numerose evidenze si sono accumulate in merito al probabile ruolo cruciale che l’enzima riveste nell’ interferire con l’attivazione di numerosi farmaci usati per contrastare la proliferazione di cellule tumorali laddove è emersa o un’espressione maggiore sia della proteina che del suo prodotto di trascrizione o forme mutate dell’enzima che lo rendono iperattivo. Tale mole di informazioni, sebbene eterogenea e ancora di difficile lettura certa, ha indotto la comunità scientifica a proporre di considerare cN-II come un potenziale target farmacologico. Per questo, numerosi sforzi si stanno compiendo per meglio definire, a lato di ciò che si sa già, il/i ruolo/i fisiologici mediati dalla cN-II, cosi da poter meglio capire per quali motivi tale proteina risulti essere enigmatica nell’ insorgenza di fenomeni di resistenza alle comuni terapie antitumorali che si avvalgono prevalentemente di analoghi nucleosidici come antimetaboliti in grado di bloccare la proliferazione cellulare maligna. In questo contesto si inserisce il mio lavoro di tesi dottorale che nell’arco dei tre anni in cui si è svolto mi ha visto lavorare a cavallo tra due gruppi di ricerca: il gruppo della Pr.ssa Maria Grazia Tozzi presso l’unità di Biochimica del dipartimento di biologia dell’ Università di Pisa e il gruppo del Pr. Charles Dumontet, sotto la supervisone del Dr. Lars Petter Jordheim, presso il Cancer Research Centre di Lione. Nella tesi che segue ho cercato dunque di meglio definire l’impatto che l’ enzima ha sul metabolismo dei nucleotidi intracellulari avvalendomi di modelli cellulari in cui l’espressione di cN-II potesse essere sia stabilmente che inducibilmente alterata. Ho utilizzato poi questi modelli per investigare gli effetti di tali alterazioni e ho cercato di porli al centro del problema dell’ insorgenza dei fenomeni di resistenza farmacologica sopra menzionati. Parallelamente ho affrontato studi in vitro di carattere biochimico con l’intento di definire la relazione tra analoghi di adenosina di prima e seconda generazione e cN-II. Inoltre ho ampliato il mio punto di vista investigativo cercando possibili interattori proteici cellulari che potessero indicare nuove vie di studio verso la conoscenza del complesso scenario in cui la cN-II si inserisce. Quello che è emerso dai miei studi è che l’ espressione di cN-II risulta critica per il mantenimento dell’omeostasi non del solo di IMP ma di molti altri nucleosidi e soprattutto nucleotidi intracellulari. Inoltre simili risposte in diversi modelli hanno confermato un ruolo chiave sia dell’ espressione che dell’ attività dell’ enzima nella proliferazione cellulare e hanno evidenziato non solo le già note correlazioni con fenomeni di resistenza all’ effetto di nucleosidi analoghi ma altresì hanno evidenziato interferenze con altre categorie antimetaboliche farmaceutiche. In aggiunta, tra gli analoghi di adenosina, è stato identificato un ruolo inibitore e interattore della fludarabina rispetto a cN-II che ha fornito delucidazioni sul meccanismo di azione citotossica del farmaco, prima non noto, e che ha posto le basi per considerare di testare la fludarabina, in quanto inibitore di un potenziale target farmacologico, in associazione ad altri farmaci in terapie farmacologiche sinergiche. Per quanto riguarda l’ indagine di possibili interattori di cN-II, è stata accertata un’ evidente e fisiologica relazione di interazione tra cN-II e Ipaf, proteina che riveste un ruolo chiave nei meccanismi immunitari innati. Tale interazione ha posto le basi per lo studio, d’ora in avanti, di cN-II come proteina regolativa di importanti fenomeni cellulari, quali l’ infiammazione e conseguente apoptosi mediata dai recettori del sistema immunitario innato. In conclusione, i risultati del lavoro mio e dei miei colleghi sono stati in parte pubblicati su riviste internazionali: S. Allegrini, D.N. Filoni, A. Galli, A. Collavoli, R. Pesi, M.G. Tozzi (2013) Expression of Bovine Cytosolic 5′-Nucleotidase (cN-II) in Yeast: Nucleotide Pools Disturbance and Its Consequences on Growth and Homologous Recombination. Plos One. 8: e63914. doi: 10.1371/journal.pone.0063914; F. Cividini, R. Pesi, L. Chaloin, S. Allegrini, M. Camici, C. Dumontet, L.P. Jordheim and M.G. Tozzi (2015) The purine analogue fludarabine acts as a cytosolic 5’-nucleotidase II inhibitor. Biochemical Pharmacology. doi:10.1016/j.bcp.2015.01.010; F. Cividini, S. M.G. Tozzi, A. Galli, R. Pesi, M. Camici, C .Dumontet, L.P. Jordheim and S. Allegrini (2015) Cytolosolic 5’-nucleotidase II interacts with the leucin rich repeats of NLR family member Ipaf. Plos One. doi: 10.1371/journal.pone.0121525; ed in parte proposti ma non ancora accettati: F. Cividini, C. Machon, R. Pesi, S. Allegrini, M. Camici, C. Dumontet, L.P. Jordheim and M.G. Tozzi. Stable modulation of cytosolic 5’-nucleotidase II in human glioblastoma ADF cells is associated with modified cell proliferation rate and sensitivity to anticancer agents. Submitted; F. Cividini, D.N. Filoni, R. Pesi, S. Allegrini, M. Camici, M.G. Tozzi. IMP-GMP specific 5’-nucleotidase regulates energy charge and prodrug metabolism. Submitted

Measurement of helicity dependence of single π0 photoproduction on deuteron

The study of the properties of the baryon resonances gives essential constraints on models for nucleon structure. Pion-photoproduction is a powerful tool to excite the nucleon to an intermediate resonant state and, in combination with polarised beams/targets, plays an important role in the investigation of the nucleon resonances. Data for polarisation observables accessible using a polarised photon beam and/or polarised nucleon targets are scarce in many channels, especially in those involving a neutron target. A systematic measurement is performed at the Mainz facility by the A2@MAMI collaboration. This talk will focus on the experiment performed at the Mainz Microtron, using a circularly polarised photon beam and a longitudinally polarised deuteron target, in conjunction with the large acceptance Crystal Ball/TAPS detection setup. An overview of the status of the experiment will be given, together with the preliminary results of polarised cross section from deuteron and of the double polarization observable E for the single π0 photoproduction reaction from the quasi-free proton and quasi-free neutron

Analisi delle relazioni tra parametri oceanografici e popolamenti di mammiferi marini nelle acque atlantiche a largo delle coste sud-occidentali del Portogallo; uno studio svolto a seguito della crociera di ricerca "Sirena '10".

Il centro di ricerche sottomarine Nato (NURC-LA SPEZIA) conduce da ormai dieci anni campagne di ricerca in Mediterraneo e, da quest’anno, in Atlantico. Il progetto “MARINE MAMMALS MITIGATION PROJECT” si pone tra i numerosi obiettivi, soprattutto quello di costruire modelli predittivi (habitat modelling), sulla base dei dataset ottenuti negli anni di ricerca, che possano definire e prevedere la presenza di mammiferi marini in una certa area. Questo risulta essere il motivo principale per il quale si conducono survey su determinate aree marine ed oceaniche. Durante l’anno 2010 e più precisamente dal 30 aprile al 14 giugno, la nave oceanografica Alliance ha visitato, campionando a livello visivo, acustico ed oceanografico, 6 differenti aree quattro delle quali caratterizzate da monti marini sommersi (Gettisburg, Josephine, Ampere-Patch Coral, Seine, Unicorn, Lion Seamounts) e le rimanenti caratterizzate, invece, da profili costieri, una, e abissali l’altra. Ai fini della ricerca gli strumenti utilizzati per il campionamento sono stati binocoli, binocoli bigeye, idrofoni e sonde ctd. Una volta a terra si è ordinata l’ingente quantità di dati acustici registrati di circa quarantacinque giorni di on-effort no stop. La mia tesi si prefigge l’obiettivo di riscontrare correlazioni tra le percentuali di abbondanza di categorie acustiche a cui fanno riferimento particolari e specifiche specie di mammiferi marini e le caratteristiche fisiche oceanografiche delle sei aree su cui è stato condotto il survey. Attraverso una semplice analisi della varianza con due fattori fissi, quali l’area e la profondità, ho riscontrato differenze significative per quanto riguarda i principali parametri oceanografici che sono legati all’attività biologica (ossigeno disciolto, fluorescenza, salinità, densità, torbidità, temperatura) tra le diverse aree campionate e le diverse profondità. Parallelamente ho riassunto, sempre per area, il numero di detezioni acustiche e il tipo di detezioni acustiche; informazioni che mi definiscono l’abbondanza di animali nell’area in questione e i taxa a cui le diverse categorie acustiche sono associate. Il passo analitico successivo mi ha portato a cercare correlazioni tra animali e caratteristiche ambientali attraverso il test non parametrico di Spearman. Sebbene per poter essere certi delle interpretazioni derivate dall’analisi sarebbe stato necessario un campionamento in più momenti dell’anno e in più anni, in quelle acque, le informazioni dedotte da quarantacinque giorni di ricerca forniscono comunque una buona idea di quelle che sono le variabili più importanti nella determinazione della distribuzione dei mammiferi marini

Double polarisation observable E and helicity dependent cross section for single π0 photoproduction off proton and neutron

Photon-induced reactions, like meson photoproduction, allow to excite the nucleon, to have access to many different polarisation observables and are an essential tool to disentangle the role of the different electromagnetic multipoles due to the change of sign of some contributions and the presence of interference terms between different multipole amplitudes. In addition, the use of polarised beams and/or targets allow to access additional observables which are fundamental in order to accurately determine the nucleon resonance properties. The A2@MAMI collaboration is carrying out a broad and systematic study on this topics, both on the proton and the neutron. The experiments are performed at the tagged photon beam facility of the MAMI accelerator in Mainz, using circularly and linearly polarised photons on longitudinally polarised proton and deuteron targets, for energies ranging from the pion production threshold up to 1.6 GeV. Hadronic reaction products are then measured with the large acceptance Crystal Ball spectrometer, complemented by charged particle and vertex detectors for tracking and identification. An overview of the results obtained so far for the double polarisation observable E (circularly polarised photon beam on a longitudinally polarised target) on the single π0 photoproduction off the proton and the neutron will be given. Furthermore, new results on the helicity-dependent total and differential cross sections on the deuteron will be presented

IMP-GMP specific cytosolic 5′-nucleotidase regulates nucleotide pool and prodrug metabolism

BACKGROUND: Type II cytosolic 5'-nucleotidase (cN-II) catalyzes the hydrolysis of purine and, to some extent, of pyrimidine monophosphates. Recently, a number of papers demonstrated the involvement of cN-II in the mechanisms of resistance to antitumor drugs such as cytarabine, gemcitabine and fludarabine. Furthermore, cN-II is involved in drug resistance in patients affected by hematological malignancies influencing the clinical outcome. Although the implication of cN-II expression and/or activity appears to be correlated with drug resistance and poor prognosis, the molecular mechanism by which cN-II mediates drug resistance is still unknown. METHODS: HEK 293 cells carrying an expression vector coding for cN-II linked to green fluorescent protein (GFP) and a control vector without cN-II were utilized. A highly sensitive capillary electrophoresis method was applied for nucleotide pool determination and cytotoxicity exerted by drugs was determined with 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay. RESULTS: Over-expression of cN-II causes a drop of nucleoside triphosphate concentration and a general disturbance of nucleotide pool. Over-expressing cells were resistant to fludarabine, gemcitabine and cytarabine independently of cN-II ability to hydrolyze their monophosphates. CONCLUSIONS: An increase of cN-II expression is sufficient to cause both a general disturbance of nucleotide pool and an increase of half maximal inhibitory concentration (IC50) of the drugs. Since the monophosphates of cytarabine and gemcitabine are not substrates of cN-II, the protection observed cannot be directly ascribed to drug inactivation. GENERAL SIGNIFICANCE: Our results indicate that cN-II exerts a relevant role in nucleotide and drug metabolism through not only enzyme activity but also a mechanism involving a protein-protein interaction, thus playing a general regulatory role in cell survival. SENTENCE: Resistance to fludarabine, gemcitabine and cytarabine can be determined by an increase of cN-II both through dephosphorylation of active drugs and perturbation of nucleotide pool

The Purine analog fludarabine acts as a cytosolic 5′-nucleotidase II inhibitor

For several years the IMP/GMP-preferring cytosolic 5′-nucleotidase II (cN-II) has been considered as a therapeutic target in oncology. Indeed, various reports have indicated associations between cN-II expression level and resistance to anticancer agents in several cancer cell lines and in patients affected with neoplasia, mainly by hematologic malignancies. In this paper we present evidence showing that, among the commonly used cytotoxic nucleoside analogs, fludarabine can act as a cN-II inhibitor. In vitro studies using the wild type recombinant cN-II demonstrated that fludarabine inhibited enzymatic activity in a mixed manner (Ki 0.5 mM and Ki′ 9 mM), whereas no inhibition was observed with clofarabine and cladribine. Additional experiments with mutant recombinant proteins and an in silico molecular docking indicated that this inhibition is due to an interaction with a regulatory site of cN-II known to interact with adenylic compounds. Moreover, synergy experiments between fludarabine and 6-mercaptopurine in human follicular lymphoma (RL) and human acute promyelocytic leukemia (HL-60) cells transfected with control or cN-II-targeting shRNA-encoding plasmids, showed synergy in control cells and antagonism in cells with decreased cN-II expression. This is in line with the hypothesis that fludarabine acts as a cN-II inhibitor and supports the idea of using cN-II inhibitors in association with other drugs to increase their therapeutic effect and decrease their resistance