Identificación de inhibidores peptídicos de proteasas con potencial aplicación biomédica obtenidos a partir de Solanum tuberosum subespecie andígena variedad Imillanegra (papa andina)

En este trabajo de tesis se obtuvieron los siguientes resultados: - Se obtuvieron extractos crudos en distintos buffers. Cada extracto fue caracterizado por electroforesis e isoelectroenfoque. - Se realizaron medidas de inhibición frente a diferentes tipos de proteasas con el fin de tener un buen espectro y de abarcar varios tipos mecanísticos de enzimas. - Los extractos crudos tuvieron actividad inhibitoria de carboxipeptidasa A, tripsina, papaína y subtilisina. - El inhibidor de tripsina fue parcialmente purificado y caracterizado a partir del extracto crudo. - El inhibidor fue caracterizado por electroforesis e isoelectroenfoque (peso molecular 20168 Da, pI bajo a partir del tratamiento del E.C. a 70ºC). - Algunos inhibidores, los menores a 20 kDa, son estables a altas temperaturas, ya que resistieron un tratamiento térmico de 70ºC durante 60 minutos recuperándose un alto porcentaje de la actividad inhibitoria. - Los inhibidores de tripsina de 21 kDa son estables a un tratamiento térmico a 60ºC durante una hora, pero a 70ºC dejan de ser estables. - Se han identificado en estos extractos, a partir de una huella peptídica de una digestión tríptica de cada una de las bandas del SDS-PAGE, los distintos componentes mayoritarios presentes en dicho extracto. - Mediante la técnica proteómica PMF/MALDI-TOF/MS se pudo identificar un inhibidor de proteasa serínica tipo KUNITZ de 21 kDa. - Mediante la técnica proteómica PMF/MALDI-TOF-TOF/MS-MS se pudo identificar el mismo inhibidor de proteasa serínica tipo KUNITZ de 21 kDa. - Mediante la técnica proteómica “Intensity Fading MALDI-TOF/MS” se pudo encontrar un inhibidor de tripsina de 20168 Da diferente del inhibidor hallado anteriormente que posee una masa de 21 kDa.Facultad de Ciencias Exacta

Identificación de inhibidores peptídicos de proteasas con potencial aplicación biomédica obtenidos a partir de Solanum tuberosum subespecie andígena variedad Imillanegra (papa andina)

En este trabajo de tesis se obtuvieron los siguientes resultados: - Se obtuvieron extractos crudos en distintos buffers. Cada extracto fue caracterizado por electroforesis e isoelectroenfoque. - Se realizaron medidas de inhibición frente a diferentes tipos de proteasas con el fin de tener un buen espectro y de abarcar varios tipos mecanísticos de enzimas. - Los extractos crudos tuvieron actividad inhibitoria de carboxipeptidasa A, tripsina, papaína y subtilisina. - El inhibidor de tripsina fue parcialmente purificado y caracterizado a partir del extracto crudo. - El inhibidor fue caracterizado por electroforesis e isoelectroenfoque (peso molecular 20168 Da, pI bajo a partir del tratamiento del E.C. a 70ºC). - Algunos inhibidores, los menores a 20 kDa, son estables a altas temperaturas, ya que resistieron un tratamiento térmico de 70ºC durante 60 minutos recuperándose un alto porcentaje de la actividad inhibitoria. - Los inhibidores de tripsina de 21 kDa son estables a un tratamiento térmico a 60ºC durante una hora, pero a 70ºC dejan de ser estables. - Se han identificado en estos extractos, a partir de una huella peptídica de una digestión tríptica de cada una de las bandas del SDS-PAGE, los distintos componentes mayoritarios presentes en dicho extracto. - Mediante la técnica proteómica PMF/MALDI-TOF/MS se pudo identificar un inhibidor de proteasa serínica tipo KUNITZ de 21 kDa. - Mediante la técnica proteómica PMF/MALDI-TOF-TOF/MS-MS se pudo identificar el mismo inhibidor de proteasa serínica tipo KUNITZ de 21 kDa. - Mediante la técnica proteómica “Intensity Fading MALDI-TOF/MS” se pudo encontrar un inhibidor de tripsina de 20168 Da diferente del inhibidor hallado anteriormente que posee una masa de 21 kDa.Facultad de Ciencias Exacta

Identificación de inhibidores peptídicos de proteasas con potencial aplicación biomédica obtenidos a partir de Solanum tuberosum subespecie andígena variedad Imillanegra (papa andina)

En este trabajo de tesis se obtuvieron los siguientes resultados: - Se obtuvieron extractos crudos en distintos buffers. Cada extracto fue caracterizado por electroforesis e isoelectroenfoque. - Se realizaron medidas de inhibición frente a diferentes tipos de proteasas con el fin de tener un buen espectro y de abarcar varios tipos mecanísticos de enzimas. - Los extractos crudos tuvieron actividad inhibitoria de carboxipeptidasa A, tripsina, papaína y subtilisina. - El inhibidor de tripsina fue parcialmente purificado y caracterizado a partir del extracto crudo. - El inhibidor fue caracterizado por electroforesis e isoelectroenfoque (peso molecular 20168 Da, pI bajo a partir del tratamiento del E.C. a 70ºC). - Algunos inhibidores, los menores a 20 kDa, son estables a altas temperaturas, ya que resistieron un tratamiento térmico de 70ºC durante 60 minutos recuperándose un alto porcentaje de la actividad inhibitoria. - Los inhibidores de tripsina de 21 kDa son estables a un tratamiento térmico a 60ºC durante una hora, pero a 70ºC dejan de ser estables. - Se han identificado en estos extractos, a partir de una huella peptídica de una digestión tríptica de cada una de las bandas del SDS-PAGE, los distintos componentes mayoritarios presentes en dicho extracto. - Mediante la técnica proteómica PMF/MALDI-TOF/MS se pudo identificar un inhibidor de proteasa serínica tipo KUNITZ de 21 kDa. - Mediante la técnica proteómica PMF/MALDI-TOF-TOF/MS-MS se pudo identificar el mismo inhibidor de proteasa serínica tipo KUNITZ de 21 kDa. - Mediante la técnica proteómica “Intensity Fading MALDI-TOF/MS” se pudo encontrar un inhibidor de tripsina de 20168 Da diferente del inhibidor hallado anteriormente que posee una masa de 21 kDa.Facultad de Ciencias Exacta

A Highly Stable Biocatalyst Obtained from Covalent Immobilization of a Non-Commercial Cysteine Phytoprotease

In this work, araujiain (enzymatic preparation obtained from the latex of Araujia hortorum fruits) was successfully immobilized on glyoxyl-agarose via multipoint covalent attachment. Thus, good efficiency of immobilization and high operational stability of immobilized enzyme were obtained. The activity of araujiain at alkaline pH was significantly improved after immobilization. In addition, immobilized araujiain also showed high activity and good stability, without significant loss in its activity, at temperatures between 37 and 60°C and in the presence of immiscible organic solvents. Immobilized araujiain also showed good performance in a mixture of 50% ethyl acetate in buffer, used for peptide synthesis, with better results than when the free enzyme was used as catalyst. These results indicate that immobilized araujiain via multipoint covalent attachment can be highly stabilized and this method might be used for practical applications of araujiain in hydrolytic and synthetic processes.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

A Highly Stable Biocatalyst Obtained from Covalent Immobilization of a Non-Commercial Cysteine Phytoprotease

In this work, araujiain (enzymatic preparation obtained from the latex of Araujia hortorum fruits) was successfully immobilized on glyoxyl-agarose via multipoint covalent attachment. Thus, good efficiency of immobilization and high operational stability of immobilized enzyme were obtained. The activity of araujiain at alkaline pH was significantly improved after immobilization. In addition, immobilized araujiain also showed high activity and good stability, without significant loss in its activity, at temperatures between 37 and 60°C and in the presence of immiscible organic solvents. Immobilized araujiain also showed good performance in a mixture of 50% ethyl acetate in buffer, used for peptide synthesis, with better results than when the free enzyme was used as catalyst. These results indicate that immobilized araujiain via multipoint covalent attachment can be highly stabilized and this method might be used for practical applications of araujiain in hydrolytic and synthetic processes.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Identificación de inhibidores peptídicos de proteasas con potencial aplicación biomédica obtenidos a partir de <i>Solanum tuberosum</i> subespecie <i>andígena</i> variedad imillanegra (papa andina)

Introducción: Los inhibidores de proteasas (IPs) tienen importantes aplicaciones en la biomedicina, la biotecnología y el diagnóstico. Una regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología humana, por esto muchas proteasas se han convertido en importantes dianas biomédicas, protagonizando casi la mitad de los fármacos del mundo para el tratamiento de patologías. Estudios con células cancerosas indicaron que algunos inhibidores actúan sobre diferentes proteasas serínicas que están implicadas en las cadenas de señalización de células tumorales, impidiendo su proliferación. Objetivos: El objetivo de este trabajo es el aislamiento, purificación e identificación de nuevos inhibidores de proteasas obtenidos a partir de tubérculos de Solanum tuberosum subespecie andígena variedad Imillanegra, provenientes de la región andina, para su potencial aplicación en el desarrollo de nuevos biofármacos. Materiales y Métodos: La combinación de la espectrometría de masas junto a la inmovilización de proteasas ha logrado desarrollar una técnica rápida y versátil “High-throughput screening” (HTS) que permite realizar un screening rápido para la identificación molecular. Esta metodología ha permitido identificar IPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. Resultados: Se encontraron nuevos inhibidores de tripsina y subtilisina (serinproteasas) que fueron caracterizados bioquímicamente. Conclusiones: Los procesos de purificación mediante inmovilización enzimática han sido claves para el aislamiento de inhibidores. Estas biomoléculas abren un camino potencial para el desarrollo de tratamientos adecuados para diversas enfermedades. Esto pudiera producir grandes avances diagnósticos y terapéuticos, lo que demuestra la importancia de estas tecnologías para la identificación y caracterización de nuevos IPs.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Formación de coronas proteicas en nanopartículas de oro y plata y sus implicancias en la terapia fotodinámica

Las nanopartículas (NPs) metálicas funcionalizadas con polímeros están atrayendo una gran atención mundial, debida al amplio alcance que ofrecen estos nanomateriales por sus propiedades físicas y químicas. La investigación de estas propiedades debe ser primordial para encontrar respuestas a sus consecuentes aplicaciones en terapias fotodinámicas. En este plan de trabajo se propone investigar la generación de oxígeno singlete (1O2) por irradiación de suspensiones de NPs de metales nobles como oro (Au) o plata (Ag) con y sin corona proteica. Con este fin se realizarán inicialmente experimentos de generación de 1O2 por irradiación in vitro y en ausencia de material biológico. La presencia de esta especie reactiva se confirmará por análisis de los productos de reacción de esta especie con sondas específicas.Universidad Nacional de La Plat

FORMACIÓN DE CORONAS PROTEICAS EN NANOPARTÍCULAS DE ORO Y PLATA Y SUS IMPLICANCIAS EN LA TERAPIA FOTODINÁMICA

Las nanopartículas (NPs) metálicas funcionalizadas con polímeros están atrayendo una gran atención mundial, debida al amplio alcance que ofrecen estos nanomateriales por sus propiedades físicas y químicas. La investigación de estas propiedades debe ser primordial para encontrar respuestas a sus consecuentes aplicaciones en terapias fotodinámicas. En este plan de trabajo se propone investigar la generación de oxígeno singlete (1O2) por irradiación de suspensiones de NPs de metales nobles como oro (Au) o plata (Ag) con y sin corona proteica. Con este fin se realizarán inicialmente experimentos de generación de 1O2 por irradiación in vitro y en ausencia de material biológico. La presencia de esta especie reactiva se confirmará por análisis de los productos de reacción de esta especie con sondas específicas. Debido a nuestro interés en la aplicación de los sistemas estudiados en terapia fotodinámica, se realizarán experimentos con células HeLa capaces de crecer en monocapas. Para ello, las células se incubarán con los nanomateriales (con y sin corona proteica) junto con los fotosensibilizadores seleccionados, y se irradiarán con luz a determinadas longitudes de onda. La incorporación de las partículas con y sin corona proteica se determinará mediante microscopía de transmisión electrónica (siglas en inglés, TEM) o microscopía de campo oscuro [1]. La citotoxicidad de células irradiadas se determinará midiendo la reducción de la sal de tetrazolio a Formazán por enzimas deshidrogenasas de las mitocondrias intactas en células vivas [2,3]. Es conocido que las NPs de Ag tienen propiedades bactericidas [4,5], mientras que existe cierta controversia sobre la toxicidad de las NPs de Au en células eucariotas [6-8]. Por estas razones, se requerirán experimentos control con los nanomateriales sin irradiar. Para investigar las características de la corona proteica que se forma alrededor de las NPs cuando se encuentran en contacto con fluidos biológicos se realizarán estudios de Resonancia de Plasmones Superficiales (siglas en inglés, SPR). Esta técnica será utilizada para monitorear las interacciones NP-proteína involucradas en la corona, por inmovilización de proteínas de la corona en la superficie sensora que será expuesta al flujo de soluciones de NPs y por estudio de la presencia de proteínas particulares de la corona, al hacer fluir NPs preincubadas con suero sobre superficies donde se ha inmovilizado un anticuerpo específico para esa proteína particular

Surface Plasmon Resonance as a Characterization Tool for Lipids Nanoparticles used in drug delivery

The development of drug carriers based in lipid nanoparticles (LNPs) aims toward the synthesis of non-toxic multifunctional nanovehicles that can bypass the immune system and allow specific site targeting, controlled release and complete degradation of the carrier components. Among label free techniques, Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensing is a versatile tool to study LNPs in the field of nanotherapeutics research. SPR, widely used for the analysis of molecular interactions, is based on the immobilization of one of the interacting partners to the sensor surface, which can be easily achieved in the case of LNPs by hydrophobic attachment onto commercial lipid- capture sensor chips. In the last years SPR technology has emerged as an interesting strategy for studying molecular aspects of drug delivery that determines the efficacy of the nanotherapeutical such as LNPs' interactions with biological targets, with serum proteins and with tumor extracelullar matrix. Moreover, SPR has contributed to the obtention and characterization of LNPs, gathering information about the interplay between components of the formulations, their response to organic molecules and, more recently, the quantification and molecular characterization of exosomes. By the combination of available sensor platforms, assay quickness and straight forward platform adaptation for new carrier systems, SPR is becoming a high throughput technique for LNPs' characterization and analysis.Fil: Chain, Cecilia Yamil. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Daza Millone, Maria Antonieta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Cisneros, José Sebastián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Ramirez, Eduardo Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Vela, Maria Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; Argentin

Efectos biológicos de inhibidores de proteasas en alimentos

Los productos naturales constituyen una de las mayores fuentes para el desarrollo de alimentos, debido a su diversidad química y a que se les supone una toxicidad inicial limitada al encontrarse en seres vivos. Entre estos productos se encuentran los inhibidores de proteasas (IPs). Las fuentes vegetales de IPs han sido escasamente exploradas y tienen la ventaja de su extraordinaria riqueza y diversidad. Tienen menor costo de obtención y procedimientos muy sencillos, si se comparan con los procedimientos de obtención por síntesis química. Seguramente el mayor incentivo para la búsqueda de nuevos IPs es que el control de la proteólisis de las proteasas propias del alimento o actividad antimicrobiana presente en el mismo representa una herramienta valiosa a la hora de conservar alimentos (Ayensa, 2002; Jin-Young et al., 2005). La combinación de la espectrometría de masas junto a la inmovilización de proteasas ha logrado desarrollar una técnica rápida y versátil “High-throughput screening” (HTS) que permite realizar un screening rápido para la identificación de moléculas. Esta metodología ha permitido identificar IPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. Por medio de IF/MALDI TOF/MS, se pudo identificar nuevos IPs obtenidos a partir de Solanum tuberosum subespecie andígena de la variedad Imillanegra (papa andina) utilizando para su purificación microcolumnas de tripsina inmovilizada en soportes de glioxil agarosa. Con todo esto se propone (aprovechando también nuestra experiencia en el estudio bioquímico y estructural de las proteínas, sus aplicaciones biotecnológicas y la infraestructura disponible en nuestro laboratorio) continuar con la detección, purificación, caracterización bioquímica y aplicación de técnicas bioinformáticas sobre nuevos inhibidores de proteasas que demuestren posibilidades de potenciales aplicaciones en el desarrollo de nuevas sustancias utilizadas en la conservación de alimentos.Facultad de Ciencias Exacta