Caracterización molecular de especies, genotipos y subtipos de cryptosporidium spp. aislados en humanos en España e identificación de giardia duodenalis por técnicas moleculares

Cryptosporidium spp. es uno de los protozoos más frecuentes relacionados con trastornos gastrointestinales, sobre todo en niños. La cryptosporidiosis es una zoonosis de distribución mundial. Giardia duodenalis produce una infección cosmopolita que afecta a humanos y animales. Causa trastornos gastrointestinales, pero también puede ser asintomática. El objeto de este estudio es avanzar en el conocimiento de las poblaciones de Cryptosporidium spp. circulantes en las provincias de Zaragoza y León, el estudio de un brote ocurrido en la provincia de Granada y también el establecimiento de un criterio para determinar la relación epidemiológica de aislamientos de Giardia duodenalis. Ciento noventa y cuatro muestras procedentes de niños de entre 0-9 años (excepto 4 muestras de adultos) previamente diagnosticadas como positivas para Cryptosporidium por microscopía y procedentes de pacientes de Zaragoza, León y Granada y aisladas entre los años 2006 y 2013 se sometieron a PCR para amplificar un fragmento del gen SSUrRNA y posterior RFLPs con SspI y VspI. Ciento cuarenta y una de ellas resultaron positivas. Todas las muestras, independientemente del análisis del gen SSU, fueron sometidas al análisis de un fragmento del gen GP60. De las 194 muestras 153 dieron positivas por uno de los métodos o ambos. Todas las muestras positivas (con SSU y GP60) se sometieron a secuenciación del amplificado para confirmar la especie detectada y detectar los subtipos. Las especies detectadas fueron: C. hominis en 115 (75.1% de los casos), C. parvum en 35 (22.9%), C. ubiquitum 2 (2%) y C. felis 1 (2%). Se subtiparon 102 muestras, identificando 18 subtipos diferentes, de los cuales el más prevalente fue el IbA10G2R2 (66% de todos los subtipos). No se encontró asociación estadísticamente significativa entre especie y ámbito. Sin embargo, la prevalencia de C. hominis resultó ser mayor que la de C. parvum tanto en el medio urbano como en el medio rural, con más del 70%. Tampoco se encontró asociación estadísticamente significativa entre especie y el mes de aislamiento, pero cuando se tomaron todas las muestras en conjunto se observó un aumento de los casos en el tercer cuatrimestre del año (46% frente a 24% del primer cuatrimestre). En cuanto al género, se observó que el número de casos de C. hominis fue igual entre hombres y mujeres mientras que C. parvum se encuentra más frecuentemente en los hombres. Analizando las asociaciones entre los subtipos encontrados y las demás variables estudiadas en el trabajo, no se ha encontrado ninguna asociación estadísticamente significativa. Este estudio representa la primera descripción en humanos de C. ubiquitum en España, y de la distribución de especies de Cryptosporidium en niños en la provincia de León. Es también la primera descripción de los subtipos IaA11R2, IfA13G1, IbA12G3R2 y IbA9G3R2 de C. hominis en los humanos en España y/o Europa, así como de los subtipos IIaA17G2R1, IIaA12G1R1, IIaA19G2R1, IIaA18G3R1, IIaA13G2R1, IIdA29G1, IIdA19G1, IIdA20G1b y IIdA17G1 de C. parvum no descritos anteriormente en humanos en España. Los resultados encontrados en el estudio de Giardia duodenalis del mismo paciente sugieren que las infecciones por este parásito se producen normalmente por una mezcla de varios genotipos pertenecientes al mismo assemblage o que existe fase de reproducción sexual en Giardia, puesto que la variabilidad genética encontrada en aislamientos procedentes de un mismo paciente es igual o mayor que la encontrada en aislamientos procedentes de pacientes diferentes incluso geográficamente alejados. Por lo tanto, los métodos utilizados para la genotipificación no permiten la diferenciación entre individuos en Giardia duodenalis. Bibliografía consultada Chalmers RM, Hadfield SJ, Jackson CJ, Elwin K, Xiao L and Hunter P (2008) Geographic Linkage and Variation in Cryptosporidium hominis. Emerg Infct Dis 14(3): 496-498. Choy SH, Mahdy MAK, Al Mekhlafi HM, Low VL and Surin J (2015) Population expansion and gene flow in Giardia duodenalis as revealed by triosephosphate isomerase gene. Parasites&Vectors 8: 454. Fayer R, Santín M, Macarisin D (2010) Cryptospordium ubiquitum n. sp. in animals and humans. Vet Parasitol 172: 23-32. Goñi P, Aldana DE, Clavel A, Seral C, Remacha MA y Castillo FJ (2010) Prevalencia de Giardia duodenalis genotipo B en humanos en Zaragoza y León, España. Emferm Infecc Microbiol Clin 20(10): 710-712. Goñi P, Almagro-Nievas D, Cieloszyk J, Lobez S, Navarro-Marí JM, Gutierrez-Fernandez J (2015) Cryptosporidiosis outbreak in child day-care center caused by an unusual Cryptosporidium hominis subtype. Enferm Infecc Microbiol Clin doi: 10.1016/j.eimc.2015.02.003 Navarro-I-Martinez L, da Silva AJ, Llovo Taboada J, Del Ágiula C, Pieniazek NJ, Bornay-Llinares FJ (2013) Molecular characterization of Cryptosporidium spp. isolated in humans in two different locations in Spain. Enferm Infecc Microbiol Clin 31(8): 506-510. Quilez J, Torres E, Chalmers RM, Robinson G, del Cacho E and Sanchez-Acedo C (2008) Cryptosporidium species and subtype analysis from dairy calves in Spain. Parasitol 135: 1613-1620. Sulaiman IM, Fayer R, Bern C, Gilman RH, Trout JM, Schantz PM, Das P, Lal AA and Xiao L (2003) Triosephosphate Isomerase Gene Characterization and Potential Zoonotic Transmission of Giardia duodenalis. Emerg Infect Dis 9(11): 1444-1452. Sulaiman IM, Hira PR, Zhou L, Al-Ali FM, Aa-Shelahi FA, Shweiki HM, Iqbal J, Khalid N, Xiao L (2005) Unique Endemicity of Cryptosporidium in Children in Kuwait. Journ Clin Microbiol 43(6): 2805-2809

El gen tpi como herramienta en los estudios epidemiolo´gicos de la giardiosis

Giardia duodenalis es un protozoo que causa infección en humanos y animales, que se puede transmitir por vía hídrica, de persona a persona o por contacto con animales, siendo una de las infecciones intestinales más frecuentes en nuestro país, por lo que supone una preocupación de Salud Pública. Su estudio epidemiológico, requiere la caracterización molecular de los parásitos, utilizando genes con gran variabilidad como el que codifica la triosafosfatoisomerasa (tpi) y analizando la homología entre aislamientos. El objetivo del trabajo es establecer el criterio de identidad que permita la comparación epidemiológica de los aislamientos de Giardia. Se recogieron 2-3 muestras de heces en días alternos, de 26 pacientes con giardiosis. Tras la extracción de ADN, se amplificaron por técnicas de PCR, un fragmento del gen tpi y un fragmento del gen de la beta-giardina (bg), que se utilizó como comparación. Los fragmentos obtenidos fueron secuenciados y las secuencias analizadas con los programas BioEdit y DnaSP v.5.0. Las secuencias del gen tpi mostraron una elevada divergencia, con valores de diversidad ¿ entre 0 y 0, 21219. La aparición de picos múltiples en el cromatograma, indicaron la presencia de varios clones en la misma muestra. Las diferencias entre aislamientos del mismo paciente fueron iguales o mayores que las encontradas para el conjunto de todas las muestras. La variabilidad del gen tpi no permite establecer unos criterios de identidad, necesarios para la identificación de aislamientos. Las infecciones mixtas intragenotipo ocurren de una forma muy frecuente, sugiriendo una implicación de la vía ambiental como principal fuente de transmisión o una variación genética muy elevada. Giardia duodenalis is a protozoon that causes infection in humans and animals. It can be transmitted by contaminated water, from person to person or by contact with animals; it being the cause one of the most common intestinal infections in our country, so it is a public health concern. The epidemiological study thereof requires the molecular characterization of parasites, using genes with great variability, such as the one that codes triosephosphate isomerase (tpi), and analizing the homology between isolates. The purpose of this work is to establish the identity criterion for epidemiological comparison of Giardia isolates. 2-3 stool samples were collected in alternate days from 26 patients with giardiasis. After DNA extraction, a fragment of the tpi gene and a fragment of the beta-giardin (bg) gene-used for comparison purposes-were amplified by means of PCR techniques. The obtained fragments were sequenced and the sequences analyzed with the BioEdit and DnaSP v.5.0 software. The tpi gene sequences showed a high divergence, with values of diversity ¿ ranging from 0 to 0.21219. The appearance of multiple peaks in the chromatogram points to the presence of various clones in the same sample. The differences between isolates from the same patient where equal or higher than those found for the collection of all samples. The variability of the tpi gene does not allow identity criteria to be established, which are necessary for isolate identification. Mixed intragenotype infections occur very frequently, which suggests the environmental path is the principal path of transmission and/or there is very high genetic variability

The tpi Gene as a Tool for Epidemiological Studies of Giardiasis

Giardia duodenalis is a protozoon that causes infection in humans and animals. It can be transmitted by contaminated water, from person to person or by contact with animals; it being the cause one of the most common intestinal infections in our country, so it is a public health concern. The epidemiological study thereof requires the molecular characterization of parasites, using genes with great variability, such as the one that codes triosephosphate isomerase (tpi), and analizing the homology between isolates.The purpose of this work is to establish the identity criterion for epidemiological comparison of Giardia isolates.2-3 stool samples were collected in alternate days from 26 patients with giardiasis. After DNA extraction, a fragment of the tpi gene and a fragment of the beta-giardin (bg) gene—used for comparison purposes—were amplified by means of PCR techniques. The obtained fragments were sequenced and the sequences analyzed with the BioEdit and DnaSP v.5.0 software.The tpi gene sequences showed a high divergence, with values of diversity Π ranging from 0 to 0.21219. The appearance of multiple peaks in the chromatogram points to the presence of various clones in the same sample. The differences between isolates from the same patient where equal or higher than those found for the collection of all samples.The variability of the tpi gene does not allow identity criteria to be established, which are necessary for isolate identification. Mixed intragenotype infections occur very frequently, which suggests the environmental path is the principal path of transmission and/ or there is very high genetic variability.</p

O gene tpi como ferramenta nos estudos epidemiológicos da giardíase

Giardia duodenalis is a protozoon that causes infection in humans and animals. It can be transmitted by contaminated water, from person to person or by contact with animals; it being the cause one of the most common intestinal infections in our country, so it is a public health concern. The epidemiological study thereof requires the molecular characterization of parasites, using genes with great variability, such as the one that codes triosephosphate isomerase (tpi), and analizing the homology between isolates.The purpose of this work is to establish the identity criterion for epidemiological comparison of Giardia isolates.2-3 stool samples were collected in alternate days from 26 patients with giardiasis. After DNA extraction, a fragment of the tpi gene and a fragment of the beta-giardin (bg) gene—used for comparison purposes—were amplified by means of PCR techniques. The obtained fragments were sequenced and the sequences analyzed with the BioEdit and DnaSP v.5.0 software.The tpi gene sequences showed a high divergence, with values of diversity Π ranging from 0 to 0.21219. The appearance of multiple peaks in the chromatogram points to the presence of various clones in the same sample. The differences between isolates from the same patient where equal or higher than those found for the collection of all samples.The variability of the tpi gene does not allow identity criteria to be established, which are necessary for isolate identification. Mixed intragenotype infections occur very frequently, which suggests the environmental path is the principal path of transmission and/ or there is very high genetic variability.Giardia duodenalis es un protozoo que causa infección en humanos y animales, que se puede transmitir por vía hídrica, de persona a persona o por contacto con animales, siendo una de las infecciones intestinales más frecuentes en nuestro país, por lo que supone una preocupación de Salud Pública. Su estudio epidemiológico, requiere la caracterización molecular de los parásitos, utilizando genes con gran variabilidad como el que codifica la triosafosfatoisomerasa (tpi) y analizando la homología entre aislamientos.El objetivo del trabajo es establecer el criterio de identidad que permita la comparación epidemiológica de los aislamientos de Giardia.Se recogieron 2-3 muestras de heces en días alternos, de 26 pacientes con giardiosis. Tras la extracción de ADN, se amplificaron por técnicas de PCR, un fragmento del gen tpi y un fragmento del gen de la beta-giardina (bg), que se utilizó como comparación. Los fragmentos obtenidos fueron secuenciados y las secuencias analizadas con los programas BioEdit y DnaSP v.5.0.Las secuencias del gen tpi mostraron una elevada divergencia, con valores de diversidad Π entre 0 y 0,21219. La aparición de picos múltiples en el cromatograma, indicaron la presencia de varios clones en la misma muestra. Las diferencias entre aislamientos del mismo paciente fueron iguales o mayores que las encontradas para el conjunto de todas las muestras.La variabilidad del gen tpi no permite establecer unos criterios de identidad, necesarios para la identificación de aislamientos. Las infecciones mixtas intragenotipo ocurren de una forma muy frecuente, sugiriendo una implicación de la vía ambiental como principal fuente de transmisión o una variación genética muy elevada.Giardia duodenalis é um protozoário que causa infeção em humanos e animais, que se pode transmitir por via hídrica, de pessoa a pessoa ou por contacto com animais, sendo uma das infeções intestinais mais frequentes no nosso país, representando uma preocupação de Saúde Pública. O seu estudo epidemiológico requer a caracterização molecular dos parasitas utilizando genes com grande variedade como o que codifica a triose-fosfato isomerase (tpi) e analisando a homologia entre isolamentos.O objetivo do trabalho é estabelecer o critério de identidade que permita a comparação epidemiológica dos isolamentos de Giardia.Recolheram-se 2-3 amostras de fezes, em dias alternados, de 26 pacientes com giardíase. Após a extração de ADN, um fragmento do gene tpi e um fragmento do gene de beta-giardina (bg) foram amplificados por técnicas de PCR, que foram utilizadas como comparação. Os fragmentos obtidos foram sequenciados e as sequências analisadas com os programas BioEdit y DnaSP v.5.0.As sequências do gene tpi mostraram uma elevada divergência, com valores de diversidade Π entre 0 e 0,21219. O aparecimento de múltiplos picos no cromatograma indicaram a presença de vários clones na mesma amostra. As diferenças entres isolamentos do mesmo paciente foram iguais ou maiores que as encontradas para o conjunto de todas as amostras.A variabilidade do gene tpi não permite estabelecer alguns critérios de identidade necessários para a identificação de isolamentos. As infeções mistas intragenótipo ocorrem de uma forma muito frequente, sugerindo uma implicação da via ambiental como principal fonte de transmissão e/ou uma variação genética muito elevada

Wyznaczanie normalnych charakterystyk podatnościowych styku powierzchni o określonej strukturze geometrycznej

In the paper, a method for determination of a normal flexibility characteristic of the contact between elements joined in a multi-bolted connection is presented. Research were carried out using equivalent samples, which substitute joined elements. An assessment of the surface texture of the samples and the joined elements is accomplished. An experimental function between normal contact pressure and normal contact deformations for investigated elements is appointed.[b]Keywords[/b]: surface texture, multi-parameter analysis, normal flexibility characteristic, multi-bolted connectio

Determination of normal flexibility characteristics of surfaces' contact with the specified surface texture

In the paper, a method for determination of a normal flexibility characteristic of the contact between elements joined in a multi-bolted connection is presented. Research were carried out using equivalent samples, which substitute joined elements. An assessment of the surface texture of the samples and the joined elements is accomplished. An experimental function between normal contact pressure and normal contact deformations for investigated elements is appointed.[b]Keywords[/b]: surface texture, multi-parameter analysis, normal flexibility characteristic, multi-bolted connectio

Cryptosporidiosis outbreak in a child day-care center caused by an unusual Cryptosporidium hominis subtype

This work was funded by DGA-FSE Research Team B82, and Project UZ2013-FIS-02 University of Zaragoza.Introduction: This work describes the genetic characterization of Cryptosporidium and Giardia involved in an outbreak in a nursery school in Granada, Spain, that affected seven children under the age of 4. Methods: Nucleic acids were extracted from the seven stool samples positive to Cryptosporidium or Giardia by microscopy and/or immunochromatography. The species and subtypes of Cryptosporidium were identified by PCR-RFLP and PCR of the SSUrRNA and gp60 genes, respectively. The assemblages of Giardia duodenalis isolates were characterized by PCR of the tpi gene. PCR products were sequenced and analyzed. Results: All of the isolates were positive for Cryptosporidium hominis. Five of them belonged to subtype IaA11R2, one to subtype IbA10G2R2, and the other could not be identified. Three of these samples were positive for G. duodenalis by PCR, two belonging to the assemblage A, and the other one to assemblage B. Discussion: This is the first report of Cryptosporidium hominis subtype IaA11R2 as a cause of an outbreak in Europe where subtype IbA10G2R2 is the most frequently identified. In the case of Giardia, an outbreak could not be confirmed because of the low number of positive samples and the low genetic variability of the amplified fragments for assemblage A of tpi gene. Conclusions: A new subtype, of Cryptosporidium hominis named IaA11R2, has been described as a cause of an outbreak in a nursery school in Granada, Spain. However an outbreak of giardiasis could not be confirmed.University of Zaragoza: DGA-FSE Research Team B82, UZ2013-FIS-0

Surface Geometry of Four Conventional Nanohybrid Resin-Based Composites and Four Regular Viscosity Bulk Fill Resin-Based Composites after Two-Step Polishing Procedure

Objectives. The aim of the study was to determine the quantitative and qualitative surface structure of contemporary RBCs in posterior teeth reconstructions: regular viscosity bulk fill and conventional composites, obtained after two-stage polishing procedure. Materials and Methods. Four conventional nanohybrid composites (Tetric EvoCeram, GrandioSO, Filtek Z550, and Ceram·X Mono) and four regular viscosity bulk fill composites (Tetric EvoCeram Bulk Fill, X-tra fil, Filtek Bulk Fill Posterior, and QuixFil) were tested. Samples of each RBC were prepared using PMMA cylindrical mold. After two-step polishing procedure, a surface geometry was evaluated under profilometry (Turbowave v. 7.36, Hommel-Etamic) and SEM (VEGA 3, Tescan Analytics). To evaluate differences between values, the following nonparametric tests were used: Friedman’s ANOVA, Wilcoxon’s matched-pair test, ANOVA Kruskal-Wallis, and Mann-Whitney U. Results. All conventional RBCs showed Ra values in the range of 0.20-0.26 μm. Bulk fill showed higher values in range of 0.49-1.36 μm except for Filtek Bulk Fill Posterior, which achieved 0.23 μm Ra value. SEM images of conventional RBCs were described as smooth surfaces with slight damage except for TEC, which presented smooth surface with no damage. Bulk fill composites showed rough surface, except for TBF, which presented smooth surface with slight damage. Conclusions. Regular viscosity bulk fill composites do not constitute a homogeneous group regarding surface roughness after polishing. They obtain, for the most part, poorer smoothness values after polishing than conventional RBCs

The tpi Gene as a Tool for Epidemiological Studies of Giardiasis

Giardia duodenalis es un protozoo que causa infección en humanos y animales, que se puede transmitir por vía hídrica, de persona a persona o por contacto con animales, siendo una de las infecciones intestinales más frecuentes en nuestro país, por lo que supone una preocupación de Salud Pública. Su estudio epidemiológico, requiere la caracterización molecular de los parásitos, utilizando genes con gran variabilidad como el que codifica la triosafosfatoisomerasa (tpi) y analizando la homología entre aislamientos.El objetivo del trabajo es establecer el criterio de identidad que permita la comparación epidemiológica de los aislamientos de Giardia.Se recogieron 2-3 muestras de heces en días alternos, de 26 pacientes con giardiosis. Tras la extracción de ADN, se amplificaron por técnicas de PCR, un fragmento del gen tpi y un fragmento del gen de la beta-giardina (bg), que se utilizó como comparación. Los fragmentos obtenidos fueron secuenciados y las secuencias analizadas con los programas BioEdit y DnaSP v.5.0.Las secuencias del gen tpi mostraron una elevada divergencia, con valores de diversidad Π entre 0 y 0,21219. La aparición de picos múltiples en el cromatograma, indicaron la presencia de varios clones en la misma muestra. Las diferencias entre aislamientos del mismo paciente fueron iguales o mayores que las encontradas para el conjunto de todas las muestras.La variabilidad del gen tpi no permite establecer unos criterios de identidad, necesarios para la identificación de aislamientos. Las infecciones mixtas intragenotipo ocurren de una forma muy frecuente, sugiriendo una implicación de la vía ambiental como principal fuente de transmisión o una variación genética muy elevada.Giardia duodenalis é um protozoário que causa infeção em humanos e animais, que se pode transmitir por via hídrica, de pessoa a pessoa ou por contacto com animais, sendo uma das infeções intestinais mais frequentes no nosso país, representando uma preocupação de Saúde Pública. O seu estudo epidemiológico requer a caracterização molecular dos parasitas utilizando genes com grande variedade como o que codifica a triose-fosfato isomerase (tpi) e analisando a homologia entre isolamentos.O objetivo do trabalho é estabelecer o critério de identidade que permita a comparação epidemiológica dos isolamentos de Giardia.Recolheram-se 2-3 amostras de fezes, em dias alternados, de 26 pacientes com giardíase. Após a extração de ADN, um fragmento do gene tpi e um fragmento do gene de beta-giardina (bg) foram amplificados por técnicas de PCR, que foram utilizadas como comparação. Os fragmentos obtidos foram sequenciados e as sequências analisadas com os programas BioEdit y DnaSP v.5.0.As sequências do gene tpi mostraram uma elevada divergência, com valores de diversidade Π entre 0 e 0,21219. O aparecimento de múltiplos picos no cromatograma indicaram a presença de vários clones na mesma amostra. As diferenças entres isolamentos do mesmo paciente foram iguais ou maiores que as encontradas para o conjunto de todas as amostras.A variabilidade do gene tpi não permite estabelecer alguns critérios de identidade necessários para a identificação de isolamentos. As infeções mistas intragenótipo ocorrem de uma forma muito frequente, sugerindo uma implicação da via ambiental como principal fonte de transmissão e/ou uma variação genética muito elevada.Giardia duodenalis is a protozoon that causes infection in humans and animals. It can be transmitted by contaminated water, from person to person or by contact with animals; it being the cause one of the most common intestinal infections in our country, so it is a public health concern. The epidemiological study thereof requires the molecular characterization of parasites, using genes with great variability, such as the one that codes triosephosphate isomerase (tpi), and analizing the homology between isolates.The purpose of this work is to establish the identity criterion for epidemiological comparison of Giardia isolates.2-3 stool samples were collected in alternate days from 26 patients with giardiasis. After DNA extraction, a fragment of the tpi gene and a fragment of the beta-giardin (bg) gene—used for comparison purposes—were amplified by means of PCR techniques. The obtained fragments were sequenced and the sequences analyzed with the BioEdit and DnaSP v.5.0 software.The tpi gene sequences showed a high divergence, with values of diversity Π ranging from 0 to 0.21219. The appearance of multiple peaks in the chromatogram points to the presence of various clones in the same sample. The differences between isolates from the same patient where equal or higher than those found for the collection of all samples.The variability of the tpi gene does not allow identity criteria to be established, which are necessary for isolate identification. Mixed intragenotype infections occur very frequently, which suggests the environmental path is the principal path of transmission and/ or there is very high genetic variability