Effect of Indirubin-3´-monoxime on platelet derived growth factor-induced vascular smooth muscle cell migration

Atherosklerose und Restenose gehören zu den vasoproliferativen Erkrankungen, die sich durch eine Anhäufung von glatten Gefäßmuskelzellen in der Intima auszeichnen. Außerdem produzieren diese glatten Gefäßmuskelzellen mehr extrazelluläre Matrix. Dies kann zu Gefäßverengung führen. Der Grund für die Anhäufung sind die erhöhte Proliferation und die Migration der glatten Gefäßmuskelzellen von der Media in die Intima, die von bestimmten Signalmolekülen ausgelöst werden. Dazu zählt Platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB), ein Faktor, der stark mitogen wirkt und zudem der stärkste bekannte chemotaktische Stimulus für glatte Gefäßmuskelzellen ist. Indirubin ist ein Inhaltsstoff aus einer Zubereitung der traditionellen chinesischen Medizin, Dang Gui Long Hui Wan. Die Zubereitung wird in der Behandlung verschiedener chronischer Erkrankungen eingesetzt, darunter Leukämie. In unserem Labor ist bereits gezeigt worden, dass Indirubin-3´-monoxime (I3MO), ein besser wasserlösliches Derivat, PDGF-BB induzierte Proliferation von glatten Gefäßmuskelzellen hemmen kann. Ebenfalls konnte in Zusammenarbeit mit Prof. Binder von der Medizinischen Universität Wien gezeigt werden, dass I3MO die Bildung einer Neointima in vivo in einem Mausmodell vermindert. Schließlich hemmt I3MO die Phosphorylierung einiger Transkriptionsfaktoren aus der STAT-Familie, ohne dabei verschiedene andere bekannte Proteinkinasen zu hemmen. In dieser Arbeit zeigen wir nun, dass I3MO konzentrationsabhängig zusätzlich zur Proliferation auch die Migration von glatten Gefäßmuskelzellen hemmt. Weiters kann es frühe Umbauten im Zellskelett beeinflussen. Zusätzlich fanden wir heraus, dass I3MO die Phosphorylierung von STAT3 und STAT5b auch nach Stimulation mit 10 ng/ml PDGF-BB hemmen konnte, also in einer Konzentration die vorwiegend zu Migration von glatten Gefäßmuskelzellen führt als zu deren Proliferation. I3MO reduzierte weiters die Expression von migrationsfördernden Zielgenen nach Stimulation mit 10 ng/ml PDGF-BB. Schließlich verglichen wir die intrazellulären Effekte von I3MO mit denen eines JAK2 Inhibitors (AG490) und mit denen eines GSK-3 Inhibitors (LiCl). Wir fanden deutliche Ähnlichkeiten in den Effekten von I3MO und AG490. Obwohl das intrazelluläre Zielprotein von I3MO noch aufgeklärt werden muss, bekräftige unsere Arbeit, dass I3MO ein vielversprechendes Molekül ist, das in der Behandlung von vasoproliferativen Erkrankungen wie Atherosklerose und Restenose eingesetzt werden könnte.The accumulation of vascular smooth muscle cells (VSMC) within the intima of the arterial walls and the increase in extracellular matrix they produce, contributes to vessel narrowing in the pathogenesis of vasoproliferative pathologies, including atherosclerosis and restenosis. The underlying mechanisms are increased proliferation and migration of VSMC from the media in the intima, caused by different growth factors and cytokines. An important proliferative stimulus, and likely the most potent chemoattractant for VSMC, is the platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB). Indirubin is an ingredient of a traditional Chinese medicine preparation, Dang Gui Long Hui Wan, which had been used in the treatment of various chronic diseases, including leukemia. Previous work in our lab has shown that indirubin-3´-monoxime (I3MO), a more soluble derivation, is able to inhibit PDGF-BB-induced VSMC proliferation. Furthermore, the compound was able to reduce neointima formation in vivo in a mouse model (experiment performed in cooperation with Prof. Binder, Medical University of Vienna). In addition, I3MO blocked phosphorylation of STATs without interfering with other common early signaling events. Here we show that in addition to its antiproliferative properties, I3MO is able to inhibit VSMC migration dose-dependently after stimulation with PDGF-BB. Furthermore it is able to interfere with early cytoskeletal rearrangements. In addition, we found that I3MO reduced STAT3 and STAT5b phosphorylation after stimulation with 10 ng/ml of PDGF-BB, a concentration leading rather to VSMC migration than to their proliferation. Moreover, I3MO reduced expression of promigratory STAT3 and STAT5b target genes after stimulation with 10 ng/ml of PDGF-BB. To further elucidate the underlying mechanisms of I3MO-effects, we compared I3MO to AG490, a chemical JAK2 inhibitor, and to LiCl, a GSK-3 inhibitor. We found considerable similarities between AG490 and I3MO regarding their intracellular actions. Although the exact cellular target remains to be investigated, our studies affirm I3MO as a promising compound in the treatment of atherosclerosis and restenosis