Evaluación de una Técnica de PCR-Múltiple para la Detección Rápida de Salmonella Typhimurium y Enteritidis en Cuyes (Cavia porcellus) Naturalmente Infectados

The aim of this study was to evaluate the detection capacity of the Multiplex Polymerase Chain Reaction (PCR) method from non-selective pre-enrichment samples (using target sequences of InvA, fliC and prot6E genes) to diagnose Salmonella Typhimurium and Enteritidis and to determine the concordance between the conventional microbiological detection method which consist of non-selective pre-enrichment, selective enrichment, differential agar isolation and biochemical tests. A total of 111 liver samples from guinea pigs with presumptive diagnosis of salmonellosis, collected in Chancay (Lima) and El Mantaro (Junín), Peru were analyzed. Salmonella Typhimurium was detected by multiplex PCR in 54% (60/111) of the samples and by microbiological analysis in 41% (45/111). A substantial concordance was found with a Kappa value of 0.64. The McNemar test showed that the results of both tests were statistically different (p<0.05).El objetivo del estudio fue evaluar la capacidad de detección de Salmonella Typhimurium y Enteritidis mediante el método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Múltiple a partir de muestras en pre-enriquecimiento no selectivo (utilizando secuencias blanco de los genes InvA, fliC y prot6E), y hallar su concordancia con el método de detección microbiológica convencional, que consta de pre-enriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, aislamiento en agar diferencial y pruebas bioquímicas. Se analizaron 111 muestras de hígado de cuyes con diagnóstico presuntivo de Salmonelosis, provenientes de Chancay (Lima) y El Mantaro (Junín), Perú. Se llegó a detectar Salmonella Typhimurium por PCR Múltiple en 54% (60/111) de las muestras y en 41% (45/111) por análisis microbiológico. Se encontró una concordancia substancial con un valor de Kappa de 0.64. La prueba de McNemar demostró que los resultados de ambas pruebas son estadísticamente diferentes (p<0.05)

Evaluación de la inmunogenicidad de una proteína recombinante de una Pasteurella multocida aislada de alpacas con neumonía

The aim of the study was to evaluate the in vitro immunogenic activity of a recombinant P6-like protein from a culture of Pasteurella multocida isolated from pneumonia cases in young alpacas. Blood peripheral mononuclear cells (PBMCs) were challenged with a recombinant P6-like protein at a concentration of 10 ng per sample, from 3 to 72 hours. Total RNA was extracted to perform the real-time RT-PCR test to observe cytokine expression levels of the Th1 immune response (TNF-α, IFN-γ and IL-2) and Th2 (IL-10 and IL-4) in the established times. Both Th1 and Th2 profile cytokines expressed a greater number of times than PBMC not exposed to the recombinant protein, where at 24 and 48 hours showed the greater expressions. Likewise, an apparent trend toward the Th2 profile was found, but at levels that did not influence the expression of cytokines in the other profile.El objetivo del estudio fue evaluar la actividad inmunogénica in vitro de una proteína P6-like recombinante procedente de un cultivo de Pasteurella multocida aislada de cuadros de neumonía en crías de alpacas. Se desafiaron cultivos de células mononucleares periféricas sanguíneas (PBMC) con una proteína recombinante P6-like a una concentración de 10 ng por muestra, desde las 3 hasta las 72 horas. Se extrajo ARN totales para realizar la prueba de RT-PCR en tiempo real para observar los niveles de expresión de citoquinas de la respuesta inmune Th1 (TNF-á, IFN-g e IL-2) y Th2 (IL-10 e IL-4) en los tiempos establecidos. Se encontró que tanto las citoquinas con perfil Th1 como Th2 expresan un mayor número de veces con respecto a PBMC no expuestos a la proteína recombinante, siendo las 24 y 48 horas los momentos de mayor expresión. Asimismo, se encontró una aparente tendencia hacia el perfil Th2, pero en niveles que no influyen en la expresión de citoquinas del otro perfil

Identificación Molecular de Salmonella Typhimurium en Cuyes al Primer Parto mediante la Técnica de PCR Múltiple

The aim of the study was to identify serotypes of suspicious isolates of Salmonella spp from breeding guinea pigs in samples collected within the first week of parturition to detect animals carrying the bacteria. The guinea pigs were clinically normal and reared in a commercial farm in Pachacamac, Lima, Peru. The farm was free of Salmonella outbreaks in the last four years. A total of 272 paired samples consisting in rectal and vaginal swabs per animal were collected and analyzed using standardized microbiological protocols. The DNA was extracted from suspected isolates of Salmonella sp and then these samples were analyzed by multiplex PCR to detect the presence of invA, prot6E and fliC genes which are specific for Salmonella spp, Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium respectively. Eight animals (12 swabs) were positive to Salmonella spp. All 12 isolates amplified invA (Salmonella spp), 10 of them amplified the fliC gene (Salmonella Typhimurium) and none the prot6E gene (Salmonella Enteritidis). The results confirmed Salmonella Typhimurium as the predominant pathogen in breeding guinea pigs at first parturition in the commercial farm.El estudio tuvo por objetivo identificar el serotipo de los aislados sospechosos de Salmonella spp de cuyes reproductoras en muestras recolectadas dentro de la semana del primer parto con el fin de detectar animales portadores de la bacteria. Los cuyes se encontraban clínicamente sanos y provenían de un criadero comercial de la zona de Pachacamac, Lima, Perú, sin registro de brote de salmonelosis desde hace cuatro años. Se evaluaron 272 muestras pareadas de hisopados rectales y vaginales usando protocolos microbiológicos estandarizados. Las cepas aisladas fueron evaluadas mediante pruebas bioquímicas y se procedió a la extracción de ADN de los aislados sospechosos de Salmonella spp. Posteriormente, estas muestras fueron analizadas mediante la técnica de PCR múltiple para detectar la presencia de los genes invA, prot6E y fliC específicos de Salmonella spp, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, respectivamente. Ocho animales (12 hisopados) resultaron positivos a Salmonella spp. Los 12 aislados amplificaron al gen invA (Salmonella spp), y de estos, 10 amplificaron para el gen fliC (Salmonella Typhimurium) y ninguno amplificó el gen prot6E (Salmonella Enteritidis). Los resultados confirmaron que Salmonella Typhimurium es el patógeno predominante en cuyes reproductoras al primer parto en esta granja de crianza comercial

Antimicrobial resistance and genotyping of Salmonella Typhimurium strains isolated from guinea pigs (Cavia porcellus) from intensive production farms of the city of Lima, Peru

El objetivo del estudio fue caracterizar 20 cepas de Salmonella enterica a nivel molecular y de resistencia antimicrobiana. De estas, 15 fueron obtenidas de cuyes infectados y cinco de cuyes clínicamente sanos, procedentes de dos centros de producción intensiva ubicados en Lima, Perú. Mediante una técnica de PCR múltiple se detectaron los genes invA, prot6E y fliC, correspondientes al género Salmonella y serovares Enteritidis y Typhimurium, respectivamente. Se detectó la variabilidad genética mediante la técnica BOX-PCR utilizando el primer BOXA1R. La resistencia fue evaluada utilizando la técnica de Kirby Bauer en base a eritromicina, nitrofurantoína, estreptomicina, penicilina, enrofloxacina, fosfomicina, amoxicilina con ácido clavulánico, sulfatrimetoprim y ciprofloxacina. Se determinó la serovariedad Typhimurium en el 100% de los aislados. La evaluación de los perfiles electroforéticos obtenidos por la técnica de BOX-PCR demostró alta homogeneidad, con patrones de bandas de ADN similares. Se detectaron cepas resistentes a eritromicina 60% (12/20), nitrofurantoína 40% (8/20), estreptomicina 30% (6/ 20), penicilina 25% (5/20), y enrofloxacina 10% (2/20). La detección de cepas resistentes puede ocasionar problemas en el tratamiento de salmonelosis en cuyes y la presencia de un solo grupo genético sugiere una dispersión clonal.The aim of this study was to characterize 20 strains of Salmonella enterica at molecular level and antimicrobial resistance. Of these, 15 strains were obtained from infected guinea pigs and five from clinically healthy guinea pigs from two intensive production centers located in Lima, Peru. The invA, prot6E and fliC genes corresponding to the genus Salmonella and serovars Enteritidis and Typhimurium, respectively, were detected by a multiple PCR technique. Genetic variability was detected using the BOX-PCR technique using the first BOXA1R. Resistance was evaluated using the Kirby Bauer technique based on erythromycin, nitrofurantoin, streptomycin, penicillin, enrofloxacin, fosfomycin, amoxicillin with clavulanic acid, sulfatrimetoprim and ciprofloxacin. Serotype Typhimurium was determined in 100% of the isolates. The evaluation of the electrophoretic profiles obtained by the BOX-PCR technique demonstrated high homogeneity, with similar DNA bands patterns. Strains resistant to erythromycin 60% (12/20), nitrofurantoin 40% (8/20), streptomycin 30% (6/20), penicillin 25% (5/20), and enrofloxacin 10% (2/20) were detected. The detection of resistant strains may cause problems in the treatment of salmonellosis in guinea pigs and the presence of only a genetic group suggests a clonal dispersion

Evaluación de la inmunogenicidad de una proteína recombinante de Pasteurella multocida para la prevención de la neumonía aguda en alpacas (Vicugna pacos)

The aim of this study was to evaluate the in vivo immunogenic capacity of a recombinant outer membrane protein of Pasteurella multocida called P6-like (rP6-like). The field trial was carried out in an alpaca production unit in Puno, Peru, and the processing of the samples was done in the Faculty of Veterinary Medicine of San Marcos University in Lima. Four groups of 5 animals were formed, and they were inoculated according to group with a) normal saline solution, b) bacterin, c) rP6-like, d) combination of bacterin + rP6-like. Blood samples were collected on days 0, 5, 7, 9, 12 and 15 post-inoculation. Single-point indirect ELISA tests were designed for the relative quantification of specific anti-rP6-like antibodies and for total anti-total P. multocida protein antibodies. The group inoculated with rP6-like showed significant elevation of antibodies from day 7 (p<0.05) until day 15 post-inoculation. The other biological products did not show significant elevation during the studied period. The study showed the immunogenic capacity of rP6- like, which allows to continue with future efficacy studies.El objetivo del presente estudio fue evaluar la capacidad inmunogénica in vivo de una proteína recombinante de membrana externa de Pasteurella multocida denominada P6-like (rP6-like). El ensayo de campo se realizó en una unidad de producción alpaquera en Puno, Perú, y el procesamiento de las muestras en la Facultad de Medicina Veterinaria de la UNMSM. Se formaron 4 grupos de 5 animales, y se inoculó, según el grupo a) solución salina normal, b) bacterina, c) rP6-like, d) combinación de bacterina + rP6-like. Se tomaron muestras de sangre en el día 0, 5, 7, 9, 12 y 15 pos-inoculación. Se diseñaron pruebas de ELISA indirecto de punto único para la cuantificación relativa de anticuerpos específicos anti rP6-like y para anticuerpos anti-proteína total de P. multocida. El grupo inoculado con rP6-like mostró elevación significativa de anticuerpos desde el día 7 (p<0.05) hasta el día 15 pos-inoculación. Los demás productos biológicos no presentaron elevación significativa durante el periodo del estudio. El estudio permitió evidenciar la capacidad inmunogénica de la rP6-like, lo cual permite continuar con futuros estudios de eficacia

Identificación de Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium en Cuyes mediante la Técnica de PCR Múltiple

The aim of this study was to identify by mutiplex PCR-based assays the possible presence of serovars Salmonella Typhimurium and Enteritidis in 25 strains of Samonella spp that were previously isolated from guinea pigs and identified by their metabolic characteristics. The molecular analysis identified all 25 strains as Salmonella Typhimurium, evidencing the primer amplification of genes invA and fliC of Salmonella spp and Salmonella Typhimurium, respectively. This study established a rapid methodology for molecular identification of Salmonella Typhimurium and Enteritidis isolated from guinea pigs.El objetivo del presente estudio fue identificar mediante PCR múltiple la posible existencia de los serovares Salmonella Typhimurium y Enteritidis en 25 cepas de Salmonella spp previamente aisladas de cuyes e identificadas por sus características metabólicas. Mediante el análisis molecular se identificaron todas las cepas como Salmonella Typhimurium, evidenciando la amplificación de los cebadores específicos para los genes invA y fliC pertenecientes al género Salmonella y Salmonella Typhimurium, respectivamente. El presente estudio permitió establecer una metodología rápida para la identificación molecular de Salmonella Typhimurium y Enteritidis aislados de cuyes

Identificación Molecular de Salmonella Typhimurium en Cuyes al Primer Parto mediante la Técnica de PCR Múltiple

The aim of the study was to identify serotypes of suspicious isolates of Salmonella spp from breeding guinea pigs in samples collected within the first week of parturition to detect animals carrying the bacteria. The guinea pigs were clinically normal and reared in a commercial farm in Pachacamac, Lima, Peru. The farm was free of Salmonella outbreaks in the last four years. A total of 272 paired samples consisting in rectal and vaginal swabs per animal were collected and analyzed using standardized microbiological protocols. The DNA was extracted from suspected isolates of Salmonella sp and then these samples were analyzed by multiplex PCR to detect the presence of invA, prot6E and fliC genes which are specific for Salmonella spp, Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium respectively. Eight animals (12 swabs) were positive to Salmonella spp. All 12 isolates amplified invA (Salmonella spp), 10 of them amplified the fliC gene (Salmonella Typhimurium) and none the prot6E gene (Salmonella Enteritidis). The results confirmed Salmonella Typhimurium as the predominant pathogen in breeding guinea pigs at first parturition in the commercial farm.El estudio tuvo por objetivo identificar el serotipo de los aislados sospechosos de Salmonella spp de cuyes reproductoras en muestras recolectadas dentro de la semana del primer parto con el fin de detectar animales portadores de la bacteria. Los cuyes se encontraban clínicamente sanos y provenían de un criadero comercial de la zona de Pachacamac, Lima, Perú, sin registro de brote de salmonelosis desde hace cuatro años. Se evaluaron 272 muestras pareadas de hisopados rectales y vaginales usando protocolos microbiológicos estandarizados. Las cepas aisladas fueron evaluadas mediante pruebas bioquímicas y se procedió a la extracción de ADN de los aislados sospechosos de Salmonella spp. Posteriormente, estas muestras fueron analizadas mediante la técnica de PCR múltiple para detectar la presencia de los genes invA, prot6E y fliC específicos de Salmonella spp, Salmonella Enteritidis y Salmonella Typhimurium, respectivamente. Ocho animales (12 hisopados) resultaron positivos a Salmonella spp. Los 12 aislados amplificaron al gen invA (Salmonella spp), y de estos, 10 amplificaron para el gen fliC (Salmonella Typhimurium) y ninguno amplificó el gen prot6E (Salmonella Enteritidis). Los resultados confirmaron que Salmonella Typhimurium es el patógeno predominante en cuyes reproductoras al primer parto en esta granja de crianza comercial