ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИЗУЧЕНИЯ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА

The results of fundamental and applied studies of blood-brain barrier had been conducted by authors during the last 10 years are summarized in the publication. The molecular anatomy of barrier microvessels, as well as promising markers of BBB and other proteins involved in barrier functions are discussed. Via in vitro experiments with endothelial cells of cerebral microvessels we characterized the basic conditions required for adequate BBB modeling. The in vivo data of BBB permeability for macromolecules in normal and different pathological processis including radiation injury, hyperosmotic shock, and nervous tissue ischemia are properly described. A particular attention was focused upon the experimental studies of the permeability and functional reorganization of barrier endothelium during tumor neoangiogenesis. We detected a dramatically increased permeability of neoplastic microvessels both for horseradish peroxidase/serum albumin and labeled monoclonal antibodies. The increased tumor permeability for IgG and the overexpression of target antigens in tumor tissue and peritumoral zone make possible the targeted delivery of diagnostics and therapeutic agents into the tumor by means of monoclonal antibodies. Работа обобщает фундаментальные и прикладные исследования гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), проведенные коллективом авторов в течение последних 20 лет. Приводятся данные, полученные при изучении молекулярной анатомии барьерных микрососудов, анализируются специфические маркеры церебрального эндотелия и белки клеток нервной ткани, ассоциированных с формированием и функционированием ГЭБ. В экспериментах по культивированию церебральных эндотелиоцитов характеризуются условия, необходимые для формирования адекватной модели ГЭБ in vitro. Анализируются результаты исследования проницаемости ГЭБ для макромолекул в норме и при различных патологических условиях (повреждение ионизирующим излучением, осмотический шок, ишемия нервной ткани). Отдельный раздел посвящен морфологическим и функциональным изменениям эндотелиоцитов церебральных микрососудов, происходящим при опухолевом неоангиогенезе. Приводятся экспериментальные данные, подтверждающие нарушение проницаемости микрососудов интрацеребральных опухолей для пероксидазы, альбумина и моноклональных антител. Обосновывается применение моноклональных антител к опухоль-ассоциированным белкам-мишеням для адресной доставки диагностических и лекарственных препаратов в головной мозг.

РОЛЬ РЕЦЕПТОРОВ VEGFR В НЕОПЛАСТИЧЕСКОМ АНГИОГЕНЕЗЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ МОЗГА

Glioblastoma (GBM) is the most common type of primary brain cancer that characterized by poor prognosis due to the rapid progression, active angiogenesis, enhanced tumor cell invasion and the emergence of resistance toward conventional therapy. In this connection, nowadays, new approaches for selective inhibition of crucial steps in tumor progression are actively developing. The key feature of tumor growth and development is angiogenesis. VEGF and its receptor VEGFR2 play the pivotal role in regulation of tumor vessel formation. Therefore, VEGFR2, as the main receptor of VEGF’s pro-angiogenic signal transducer, is a promising molecular target for anti-angiogenic therapy. There is evidence that inhibitors of VEGF and VEGFR2 reduce endothelial cell proliferation, migration and survival that lead to regression of vessel density and decrease vascular permeability, thereby slowing tumor growth. Currently, a number of VEGFR2 inhibitors are under clinical trials (ramucirumab, cediranib) and several were approved (sunitinib, sorafenib). Despite the promising results of preclinical studies, the efficacy of antiangiogenic drugs in the clinical practice is significantly lower, mainly, due to rapid adaptation of malignant cells that consists of alternative pro-angiogenic pathways activation, recruitment of endothelial progenitor cells from bone marrow and increasing of the invasive growth. Given the diversity of pro-angiogenic mechanisms, enhancement of the efficacy of tumor therapy could be achieved by specific inhibition of VEGFR2 functions that will be supplemented by other antiangiogenic drugs (anti-VEGF,-PlGF,-HIF1α). In addition, multitargeting therapy should focus on the combined inhibition of angiogenesis, invasion, metastasis, proliferation and survival of tumor cells. Ввиду быстрой прогрессии, активного ангиогенеза, интенсивной инвазии и резистентности опухолей мозга, подходы к традиционной терапии остаются малоэффективными. В связи с этим активно изучают новые стратегии избирательного ингибирования критических стадий опухолевой прогрессии. Важнейшим фактором развития и роста солидных опухолей является неопластический ангиогенез, ключевую роль в регуляции которого играет фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор 2-го типа (VEGFR2). Именно поэтому VEGFR2 как основной рецептор трансдукции проангиогенного сигнала рассматривают в качестве молекулярной мишени для антиангиогенной терапии. Ингибиторы VEGF и VEGFR2 подавляют пролиферацию, миграцию и выживаемость эндотелиоцитов, что приводит к регрессии сосудистой сети, снижению плотности и проницаемости сосудов; таким образом, замедляется рост опухоли. В настоящее время ряд ингибиторов VEGFR2 (рамуцирумаб, цедираниб) проходит клинические испытания. Несмотря на многообещающие результаты экспериментальных исследований, эффективность антиангиогенных препаратов в клинической практике оказывается существенно ниже. Это связано прежде всего с адаптивной устойчивостью малигнизированных клеток, которая включает активацию альтернативных проангиогенных путей, рекрутирование предшественников эндотелиальных клеток из костного мозга и увеличение вклада инвазивного роста. Учитывая многообразие существующих проангиогенных сигнальных механизмов, для повышения эффективности противоопухолевой терапии специфическое подавление функций VEGFR2 необходимо дополнять другими антиангиогенными препаратами (анти-VEGF, -PlGF, -HIF1α). Кроме того, мультитаргетная стратегия должна быть направлена на комбинированное подавление ангиогенеза, инвазии, метастазирования, пролиферации и выживаемости опухолевых клеток.

РОЛЬ VEGF В РАЗВИТИИ НЕОПЛАСТИЧЕСКОГО АНГИОГЕНЕЗА

Solid tumor progression largely depends on vascularization and angiogenesis in the malignant tissue. The most prominent among all proangiogenic factors is vascular endothelium growth factor (VEGF). VEGF suppression leads to retrogression of neoplastic vessels and tumor growth restriction. Clinical trials of complex antiangiogenic and chemical therapy of different neoplastic tumors have shown promising results. Nowadays bevacizumab is widely used in breast cancer, colorectal cancer and II-IV stage of malignancy gliomas treatment. Unfortunately, in the majority of cases antiangiogenic treatment led not to full recovery, but only to tumor development restriction. Resistance mechanisms include potentiating of alternative proangiogenic signaling pathways and activation of malignant cell invasive population.Прогрессия солидных опухолей во многом зависит от степени васкуляризации и ангиогенеза малигнизированной ткани. Из целого спектра проангиогенных факторов наиболее серьезное значение имеет фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Подавление функций VEGF приводит к регрессии неопластических сосудов и ограничению роста опухоли. Многообещающие результаты продемонстрировали клинические испытания комплексной антиангиогенной и химиотерапии различных неопластических образований. В настоящее время препарат бевацизумаб вошел в широкую клиническую практику при терапии рака молочной железы, колоректального рака и глиом III–IV степени злокачественности. К сожалению, в большинстве случаев антиангиогенная терапия не приводит к полному выздоровлению, а лишь замедляет развитие опухоли. Механизмы резистентности включают потенцирование альтернативных проангиогенных сигнальных путей и активацию инвазивной популяции опухолевых клеток

Characterization of new cell line stably expressing CHI3L1 oncogene

Aim. To characterize the immortalized 293 cell line afterstable transfection with human oncogene (CHI3L1). Methods. 293 cells, stably transfected with pcDNA3.1_CHI3L1, and 293 cells, stably transfected with pcDNA3.1 as a negative control, were used throughout all experiments. The clones of CHI3L1-expressing 293 cells and 293 cells, transfected with pcDNA3.1, were analyzed by immunofluorescence and confocal microscopy. Cell proliferation was measured using MTT assay; analyses of ERK1/2 and AKT activation and their cellular localization were performed with anti-phospho-ERK and anti-phospho-AKT antibodies. Specific activation of MAP and PI3 kinases was measured by densitometric analysis of Western-blot signals. Results. The obtained results show quite modest ability of CHI3L1 to stimulate cell growth and reflect rather an improved cellular plating efficiency of the 293 cells stably transfected with pcDNA3.1_CHI3L1 as compared to the 293 cells transfected with an «empty» vector. ERK1/2 and AKT are activated in the 293_CHI3L1 cells. In these cells phosphorylated ERK1/2 were localized in both cell cytoplasm and nuclei while AKT only in cytoplasm. The 293_CHI3L1 cells differed from the 293 cells, transfected with an «empty» vector, in their size and ability to adhere to the culture plates. Conclusions. The overexpression of CHI3L1 is likely to have an important role in tumorigenesis via a mechanism which involves activation of PI3K and ERK1/2 pathways. The tumors which can be induced by orthotopic implantation of the transformed human cells with overexpressed human oncogene CHI3L1 into the rat brain can be used as a target for anticancer drug development. Key words: chitinase 3-like 1 protein (CHI3L1), brain tumor, MAP kinase, PI3 kinase.Мета. Охарактеризувати імморталізовану клітинну лінію 293 після стабільної трансфекції онкогена CHI3L1. Методи. Клітини 293, стабільно трансфековані pcDNA3.1_CHI3L1, та клітини 293, стабільно трансфековані pcDNA3.1 як негативний контроль, використано в усіх експериментах. Клони 293 експресуючих CHI3L1 клітин та клітини 293, трансфековані «порожнім» вектором, проаналізовано методами імунофлуоресценції та конфокальної мікроскопії. Клітинну проліферацію визначено за допомогою MTT, активацію ERK1/2 i AKT та їxню локалізацію в клітинax – із застосуванням анти-фосфо-ERK- та анти-фосфо-AKT-антитіл. Специфічну активацію кіназ MAP і PI3 визначено денситометричним аналізом Вестерн-блот сигналів. Результати. Отримані результати демонструють помірну здатність CHI3L1 стимулювати клітинний ріст, алe відображають скоріше підвищену здатність до прикріплення 293 клітин, стабільно трансфекованих pcDNA3.1_CHI3L1 порівняно з клітинами 293, трансфекованими «порожнім» вектором. У 293_ CHI3L1 клітинах ERK1/2 та AKT перебувають в активованому стані. У цих клітинах фосфорильованi ERK1/2 локалізованi як у цитоплазмі, так і в ядрі, тоді як AKT – лише в цитоплазмі. 293_CHI3L1-клітини відрізняються від клітин 293_pcDNA3.1 за морфологією та їхньою здатністю до прикріплення до культуральних чашок. Висновки. Нaдeкспресія CHI3L1, очевидно, має важливе значення в пухлиноутворунні і опоседковується активацією PI3K- і MAPK- сигнальних шляхів. Пухлини, спричинені ортотопічною імплантацією трансформованих клітин людини з нaдекспресованимCHI3L1 у мозок щурів, стають вірогідною мішенню для антиракової терапії. Ключові слова: хітиназа 3-подібний білок 1 (CHI3L1), пухлини гoлoвного мозку, MAP-кіназа, PI3-кіназа.Цель. Охарактеризовать иммортализованную клеточную линию 293 после стабильной трансфекции онкогена CHI3L1. Методы. Клетки 293, стабильно трансфецированные pcDNA3.1_CHI3L1, и клетки 293, стабильно трансфецированные pcDNA3.1 в качестве отрицательного контроля, использованы во всех экспериментах. Клоны 293_CHI3L1 и клетки 293_ pcDNA3.1 анализировали методами иммунофлюоресценции и конфокальной микроскопии. Клеточную пролиферацию определяли с помощью MTT, активацию и локализацию ERK1/2 и AKT анализировали с применением анти-фосфо-ERK- и анти-фосфо-AKT-антител. Специфическую активацию MAP- и PI3-киназ определяли денситометрическим анализом Вестерн-блот сигналов. Результаты. Полученные ре - зультаты демонстрируют умеренную способность CHI3L1 стимулировать клеточный рост и отражают скорее повышенную способность к прикреплению клеток, стабильно трансфецированных pcDNA3.1_CHI3L1 по сравнению с 293-клетками, транс - фецированными «пустым» вектором. ERK1/2 и AKT в клетках 293_CHI3L1 находятся в активированном состоянии. В этих клетках фосфорилированныe ERK1/2 локализованы как в цитоплазме, так и в ядре, в то время как AKT – только в цитоплазме. Клетки 293_CHI3L1 отличаются от клеток 293_pcDNA3.1 по морфологии и способности прикрепления к культуральным чашкам. Выводы. Сверхэкспрессия CHI3L1, очевидно, имеет важное значение в опухолеобразовании и опосредуется активацией PI3Kи MAPK-сигнальных путей. Опухоли, которые индуцируются ортотопической имплантацией трансформированных человеческих клеток со сверхэкспрессированным CHI3L1 в мозг крыс, мо - гут служить мишенью для антираковой терапии. Ключевые слова: хитиназа 3-подобный белок 1 (CHI3L1), опухоли гoлoвного мозга, MAP-киназа, PI3-киназ

Клеточная терапия при травмах спинного мозга

The opportunities and the most promising ways of using cellular technology in traumatic spinal cord injury are considered in this review. A large number of experimental and clinical studies with the use of different types of cells: embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, Schwann cells, olfactory mucosa cells, and others – was conducted. The use of these types of cells in traumatic spinal cord injury treatment often demonstrated a positive therapeutic effect: the motor and sensory function recovery of the spinal cord. However, some types of cell preparations involve some methodological and ethical problems; some types of cell therapies are ineffective or give rise to side effects. These factors complicate the selection of optimal cell therapy for the traumatic spinal cord injury treatment. The most promising cells seem to be the cells of the olfactory mucosa. Getting the olfactory mucosa is considered to be a feasible and safe procedure for patients. The clinical application of the cells of the olfactory mucosa is effective in motor function recovery due to remyelination and axonal regeneration after spinal cord injury. These cells are tissue-specific and autologous since they can be obtained from a patient with spinal cord injury, and after cultivation, expansion, and directed differentiation they can be transplanted to the same patient. The presented benefits of olfactory mucosa cells open up the possibility for its clinical application in the cell therapy. В обзоре уделяется внимание возможностям и наиболее перспективным направлениям клеточной терапии при травмах спинного мозга. Результаты экспериментальных работ и клинических исследований с использованием различных типов клеток ― эмбриональных стволовых, индуцированных плюрипотентных, мезенхимальных стволовых, Шванновских, клеток обонятельной выстилки и др. ― при травматических повреждениях спинного мозга во многих случаях продемонстрировали положительный терапевтический эффект с восстановлением сенсорной и моторной функций спинного мозга. Однако отмечено, что использование отдельных клеточных препаратов связано с определенными методическими и этическими проблемами, а применение некоторых типов клеток малоэффективно или приводит к нежелательным побочным эффектам. Наиболее перспективными показали себя клетки обонятельной выстилки, при этом процедура их получения доступна и безопасна для пациентов. Применение клеток обонятельной выстилки достаточно эффективно для восстановления двигательной функции вследствие ремиелинизации и регенерации аксонов после повреждения спинного мозга. Данные клетки являются тканеспецифичными и аутологичными, поскольку могут быть получены от пациента с травмой спинного мозга и после наращивания в культуре и направленной дифференцировки трансплантированы тому же самому пациенту. Такие преимущества клеток обонятельной выстилки открывают широкие возможности их применения в клеточной терапии при травмах спинного мозга

РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ РАННЕЙ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРОСТАТЫ, ОСНОВАННОЙ НА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ДЕТЕКЦИИ МРНК ГЕНА PCA3 В ОСАДКЕ МОЧИ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

The wide introduction of prostatic specific antigen (PSA) determination into clinical practice has resulted in a larger number of prostate biopsies, while the lower age threshold for PSA has led to a larger number of unnecessary prostate biopsies. Hence, there is a need for new biomarkers that can detect prostate cancer. РCА3 is a noncoding messenger ribonucleic acid (mRNA) that is expressed exclusively in prostate cells.  The aim of the study  has been to develop a diagnostic test system for early non-invasive detection of prostate cancer based on PCA3 mRNA levels in urine sediment using quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). As part of the study, a laboratory diagnostic test system prototype has been designed, an application methodology has been developed and specificity and sensitivity data of the method has been assessed. The diagnostic system has demonstrated its ability to detect significantly elevated levels of PCA 3/ KLK 3 in samples from prostate cancer (PCa) patients compared with those from healthy men. The findings have shown relatively high diagnostic sensitivity, specificity and negative-predictive values for an early non-invasive screening of prostate cancerШирокое внедрение в клиническую практику определения содержания простатического специфического антигена (ПСА) привело к увеличению числа выполняемых биопсий простаты, а снижение порога возрастных норм ПСА — к увеличению числа неоправданных биопсий. В связи с этим возникла необходимость в новых биомаркерах рака предстательной железы. РСА3 — некодирующая мРНК, которая экспрессируется исключительно клетками предстательной железы. Целью данной работы было разработать диагностическую тест-систему для ранней неинвазивной диагностики рака простаты, основанной на количественной детекции мРНК гена РСА3 в осадке мочи методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ). В результате был создан лабораторный образец диагностической ПЦР-тест-системы и отработана методика его применения. Получены данные о специфичности и чувствительности разработанного метода. Показана способность диагностической системы выявлять значительное превышение параметра PCA3/KLK3 в образцах биоматериала, полученного от больных раком простаты, по сравнению с образцами от здоровых индивидуумов. В ходе проведенных исследований установлены достаточно высокие показатели диагностической чувствительности, специфичности и негативной предсказательной ценности для раннего неинвазивного скринингово обнаружения рака предстательной железы. 

Liposomal formulations of anthracycline antibiotics

Anthracycline antibiotics with significant antitumor activity are widely used for treatment of various oncologic diseases in spite of their poor pharmacokinetics and severe side-effects. To improve the efficacy of treatment of oncologic patients, liposomal formulations of the anthracycline antibiotics, such as Doxil, TLC D-99, and DaunoXome, have been developed. Pharmacokinetic parameters of liposomal doxorubicin and daunorubicin differ markedly from the parameters of their free formulations. Liposomal anthracyclines display a prolonged circulation time, reduced clearance, smaller volume of distribution, and lower toxicity. Doxil and DaunoXome have been licensed for treatment of AIDS-related Kaposi's sarcoma. Entrapment of anthracycline antibiotics into liposomes coupled with monoclonal antibodies enhances their uptake by tumor cells

Liposomal formulations of anthracycline antibiotics

Anthracycline antibiotics with significant antitumor activity are widely used for treatment of various oncologic diseases in spite of their poor pharmacokinetics and severe side-effects. To improve the efficacy of treatment of oncologic patients, liposomal formulations of the anthracycline antibiotics, such as Doxil, TLC D-99, and DaunoXome, have been developed. Pharmacokinetic parameters of liposomal doxorubicin and daunorubicin differ markedly from the parameters of their free formulations. Liposomal anthracyclines display a prolonged circulation time, reduced clearance, smaller volume of distribution, and lower toxicity. Doxil and DaunoXome have been licensed for treatment of AIDS-related Kaposi's sarcoma. Entrapment of anthracycline antibiotics into liposomes coupled with monoclonal antibodies enhances their uptake by tumor cells