A single serine residue determines selectivity to monovalent metal ions in metalloregulators of the MerR family

MerR metalloregulators alleviate toxicity caused by an excess of metal ions, such as copper, zinc, mercury, lead, cadmium, silver, or gold, by triggering the expression of specific efflux or detoxification systems upon metal detection. The sensor protein binds the inducer metal ion by using two conserved cysteine residues at the C-terminal metal-binding loop (MBL). Divalent metal ion sensors, such as MerR and ZntR, require a third cysteine residue, located at the beginning of the dimerization (α5) helix, for metal coordination, while monovalent metal ion sensors, such as CueR and GolS, have a serine residue at this position. This serine residue was proposed to provide hydrophobic and steric restrictions to privilege the binding of monovalent metal ions. Here we show that the presence of alanine at this position does not modify the activation pattern of monovalent metal sensors. In contrast, GolS or CueR mutant sensors with a substitution of cysteine for the serine residue respond to monovalent metal ions or Hg(II) with high sensitivities. Furthermore, in a mutant deleted of the Zn(II) exporter ZntA, they also trigger the expression of their target genes in response to either Zn(II), Cd(II), Pb(II), or Co(II).Fil: Ibáñez, María Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Checa, Susana Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Soncini, Fernando Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Dissecting the Metal Selectivity of MerR Monovalent Metal Ion Sensors in Salmonella

Two homologous transcription factors, CueR and GolS, that belong to the MerR metalloregulatory family are responsible for Salmonella Cu and Au sensing and resistance, respectively. They share similarities not only in their sequences, but also in their target transcription binding sites. While CueR responds similarly to Au, Ag, or Cu to induce the expression of its target genes, GolS shows higher activation by Au than by Ag or Cu. We showed that the ability of GolS to distinguish Au from Cu resides in the metal-binding loop motif. Here, we identify the amino acids within the motif that determine in vivo metal selectivity. We show that residues at positions 113 and 118 within the metal-binding loop are the main contributors to metal selectivity. The presence of a Pro residue at position 113 favors the detection of Cu, while the presence of Pro at position 118 disfavors it. Our results highlight the molecular bases that allow these regulators to coordinate the correct metal ion directing the response to a particular metal injury.Fil: Ibáñez, María Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Cerminati, Sebastián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Checa, Susana Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Soncini, Fernando Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

Chaperones moleculares : su rol en el proceso de plegamiento y ensamble intracelular de proteínas

El plegamiento de las proteínas a su conformación nativa constituye una de las bases para el correcto funcionamiento celular. La eficiencia del proceso es asegurada in vivo gracias a la participación entre otros, de sistemas especializados de proteínas denominados chaperones moleculares. Estos asistentes de plegado interaccionan no covalentemente con polipéptidos total o parcialmente desplegados favoreciendo el plegado productivo por sobre las reacciones no productivas que conducen a la agregación en condiciones fisiológicas y de estrés. Numerosas evidencias experimentales indican que distintos chaperones pueden cooperar en las células. Se ha propuesto que los sistemas de chaperones Hsp70/DnaK y Hsp60/GroE actúan secuencialmente asistiendo el plegamiento de proteínas recién sintetizadas o desnaturalizadas y el importe de éstas a organelas. Sin embargo, la transferencia secuencial parece no ocurrir en todos los casos y por ello se ha propuesto la existencia de redes flexibles y funcionales …Fil: Checa, Susana Karina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Microbiología. Área Microbiología Básica; Argentina

The metal-binding loop size defines proper ion-ligand interaction and signal transduction in CueR-like sensors

Bacteria resistance to toxic transition metals depends on transcriptional regulators that detect the metal ion and activate the expression of factors that remove or neutralize the harmful species, restoring homeostasis. Our group is focus on metallo-regulators of the MerR family, dimeric proteins that interact with toxic ions in the cytoplasm and modify the promoter conformation to enhance recognition by the RNA polymerase. The ability of MerR proteins to discriminate between metals is essential to achieve a proper response to a specific stress, and depends mainly on the array of specific ligand (cysteine or histidine residues) at the metal coordination environment. Based on these key residues, two groups can be distinguished: one including members that recognize Cu(I), Ag(I) or Au(I), and the other that interact with divalent ions such as Zn(II), Pb(II), Cd(II) or Hg(II). While most of these sensors are poorly selective, like the ancestral CueR or ZntR sensors, some evolved to achieve preferential recognition to one specific metal ion, such as GolS, the Au(I)-sensor from Salmonella. Previously, we demonstrated that two residues within α5-α6 metal-binding loop (MBL) of GolS favor Au(I)-sensing over Cu(I) or Ag(I). To analyze the contribution of the MBL to the evolution of monovalent and divalent metal sensors, we applied site-directed mutagenesis and domain swapping to generate a set of GolS, CueR and ZntR variants with modifications in both the size and the identity of residues composing MBL. The functionality of these mutant sensors was investigated by assessing the activation of specific reporter genes followed by in silico modelling. The results obtained indicate that the size of the MBL is optimized in most sensors to allow the adequate arrangement of ligands in order to improve the interaction with the inducer metals. Some CueR variants also modified the pattern of metal specificity, lowering their affinity for some of their original inducers while keeping parental response to others. Our results highlight the relevance of other regions outside the MBL of CueR for adequately driving the inductor signal to the distal DNA-binding region and activate the transcription of their target genes.Fil: Mendoza, Julián I.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Checa, Susana Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaXXIV Congreso Latinoamericano de Microbiología. XL Congreso Chileno de Microbiología. II Reunión Anual de la Asociación Chilena de Inmunología. IX Reunión Anual de la Sociedad Latinoamericana de Tuberculosis y otras MicrobacteriosisSantiago de ChileChileAsociación Latinoamericana de Microbiologí

A sensitive whole-cell biosensor for the simultaneous detection of a broad-spectrum of toxic heavy metal ions

Bacterial biosensors are simple, cost-effective and efficient analytical tools for detecting bioavailable heavy metals in the environment. This work presents the design, construction and calibration of a novel whole-cell fluorescent biosensory device that, simultaneously and with high sensitivity, reports the presence of toxic mercury, lead, cadmium and/or gold ions in aqueous samples. This bio-reporter can be easily applied as an immediate alerting tool for detecting the presence of harmful pollutants in drinking water.Fil: Cerminati, Sebastián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Soncini, Fernando Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Checa, Susana Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

CpxR/CpxA controls scsABCD transcription to counteract copper and oxidative stress in Salmonella enterica serovar Typhimurium

Periplasmic thiol/disulfide oxidoreductases participate in the formation and isomerization of disulfide bonds and contribute to the virulence of pathogenic microorganisms. Among the systems encoded in the Salmonella genome, the system encoded by the scsABCD locus was shown to be required to cope with Cu and H2O2 stress. Here we report that this locus forms an operon whose transcription is driven by a promoter upstream of scsA and depends on CpxR/CpxA and on Cu. Furthermore, genes homologous to scsB, scsC, and scsD are always detected immediately downstream of scsA and in the same genetic arrangement in all scsA-harboring enterobacterial species. Also, a CpxR-binding site is detected upstream of scsA in most of those species, providing evidence of evolutionarily conserved function and regulation. Each individual scs gene shows a different role in copper and/or H2O2 resistance, indicating hierarchical contributions of these factors in the defense against these intoxicants. A protective effect of Cu preincubation against H2O2 toxicity and the increased Cu-mediated activation of cpxP in the ΔscsABCD mutant suggest that the CpxR/CpxA-controlled transcription of the ScsABCD system contributes to prevent Cu toxicity and to restore the redox balance at the Salmonella envelope.Fil: López, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Checa, Susana Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Soncini, Fernando Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

GolS controls the response to gold by the hierarchical induction of Salmonella-specific genes that include a CBA efflux-coding operon

Salmonella employs a specific set of proteins that allows it to detect the presence of gold salts in the environment and to mount the appropriate resistance response. This includes a P-type ATPase, GolT, and a small cytoplasmic metal-binding protein, GolB. Their expression is controlled by a MerR-like sensor, GolS, which is highly selective for Au ions. Here, we identify a new GolS-controlled operon named gesABC which codes for a CBA efflux system, and establish its role in Au resistance. GesABC can also mediate drug resistance when induced by Au in a GolS-dependent manner, in a strain deleted in the main drug transporter acrAB. The GolS-controlled transcription of gesABC differs from the other GolS-regulated loci. It is activated by gold, but not induced by copper, even in a strain deleted of the main Cu transporter gene copA, which triggers a substantial GolS-dependent induction of golTS and golB. We demonstrate that the Au-dependent induction of gesABC transcription requires higher GolS levels than for the other members of the gol regulon. This correlates with a divergent GolS operator in the gesABC promoter. We propose that the hierarchical induction within the gol regulon allows Salmonella to cope with Au-contaminated environments.Fil: Pontel, Lucas Blas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Pérez Audero, María Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Espariz, Martin. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Checa, Susana Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Soncini, Fernando Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin

The protein scaffold calibrates metal specificity and activation in MerR sensors

MerR metalloregulators are the central components of many biosensor plat-forms designed to report metal contamination. However, most MerR proteins are non-specific. This makes it difficult to apply these biosensors in the analy-sis of real environmental samples. On-demand implementation of molecular engineering to modify the MerR metal preferences is innovative, although it does not always yield the expected results. As the metal binding loop region (MBL) of these sensors has been proposed to be the major modulator of their specificity, we surgically switched this region for that of well-characterized specific and non-specific homologues. We found that identical modifications in different MerR proteins result in synthetic sensors displaying particular metal-detection patterns that cannot be predicted from the nature of the as-sembled modules. For instance, the MBL from a native Hg(II) sensor provided non-specificity or specificity toward Hg(II) or Cd(II) depending on the MerR scaffold into which it was integrated. These and other evidences reveal that residues outside the MBL are required to modulate ion recognition and trans-duce the input signal to the target promoter. Revealing their identity and their interactions with other residues is a critical step toward the design of more efficient biosensor devices for environmental metal monitoring.Fil: Mendoza, Julián. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (CONICET-IBR); Argentina.Fil: Lescano, Julián. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (CONICET-IBR); Argentina.Fil: Soncini, Fernando. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (CONICET-IBR); Argentina.Fil: Soncini, Fernando C. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Microbiología; Argentina.Fil: Checa, Susana Karina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (CONICET-IBR); Argentina.Fil: Checa, Susana Karina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Departamento de Microbiología; Argentina

Evolution of Copper Homeostasis and Virulence in Salmonella

Salmonella enterica sv. Typhimurium modulates the expression of factors essential for virulence, contributing to its survival against the surge of copper (Cu) in the Salmonella-containing vacuole. This bactericidal host innate immune component primarily targets the bacterial envelope, where most cuproproteins are localized. While in most enteric species periplasmic Cu homeostasis is maintained by the CusR/CusS-controlled CusCFBA efflux system encoded in the cus locus, we noticed that these genes were lost from the Salmonella-core genome. At the same time, Salmonella acquired cueP, coding for a periplasmic Cu chaperone. As cus, cueP was shown to be essential for bacterial survival in a copper-rich environment under anaerobiosis, suggesting that it can functionally substitute the CusCFBA system. In the present study, the whole Escherichia coli cus locus was reintroduced to the chromosome of the Salmonella wild-type or th 1cueP strain. While the integrated cus locus did not affect Cu resistance under aerobic conditions, it increases Cu tolerance under anaerobiosis, irrespective of the presence or absence of cueP. In contrast to the Cus system, CueP expression is higher at high copper concentrations and persisted over time, suggesting separate functions. Finally, we observed that, regardless of the presence or absence of cus, a mutant deleted of cueP shows a deficiency in replication inside macrophages compared to the wild- type strain. Our results demonstrate that CueP and CusCFBA exert redundant functions for metal resistance, but not for intracellular survival, and therefore for the virulence of this pathogen.Fil: Méndez, Andrea A. E. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Mendoza, Julián I. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Echarren, María Laura. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Terán, Ignacio. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Checa, Susana Karina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.Fil: Soncini, Fernando C. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

The protein scaffold calibrates metal specificity and activation in MerR sensors

MerR metalloregulators are the central components of many biosensor platforms designed to report metal contamination. However, most MerR proteins are non-specific. This makes it difficult to apply these biosensors in the analysis of real environmental samples. On-demand implementation of molecular engineering to modify the MerR metal preferences is innovative, although it does not always yield the expected results. As the metal binding loop region (MBL) of these sensors has been proposed to be the major modulator of their specificity, we surgically switched this region for that of well-characterized specific and non-specific homologues. We found that identical modifications in different MerR proteins result in synthetic sensors displaying particular metal-detection patterns that cannot be predicted from the nature of the assembled modules. For instance, the MBL from a native Hg(II) sensor provided non-specificity or specificity toward Hg(II) or Cd(II) depending on the MerR scaffold into which it was integrated. These and other evidences reveal that residues outside the MBL are required to modulate ion recognition and transduce the input signal to the target promoter. Revealing their identity and their interactions with other residues is a critical step toward the design of more efficient biosensor devices for environmental metal monitoring.Fil: Mendoza Fernández, Julián Ignacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Lescano, Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Soncini, Fernando Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; ArgentinaFil: Checa, Susana Karina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentin