Synthèse et caractérisation de sondes lipidiques macromoléculaires fluorescentes émettant dans le rouge lointain pour l'imagerie membranaire

Ce projet de thèse consistait à synthétiser de nouveaux bio-conjugués Lipide-Polymère fluorescents émettant dans le rouge lointain, composés d une chaîne polymère portant à la fois de nombreux chromophores en position latérale et un lipide en extrémité de chaîne. La structure de ces bio-conjugués est basée sur des copolymères poly(N-acryloylmorpholine-co-N-acryloxysuccinimide), hydrophiles, réactifs, modulables et d architecture contrôlée obtenus par le procédé RAFT. Les copolymères réactifs ont ensuite été utilisés pour le couplage, en position latérale, de chromophores émettant dans le rouge lointain. La stratégie utilisée pour la synthèse des bio-conjugués se divise en trois étapes : la synthèse d Agents de Transfert de Chaîne (ATC) fonctionnalisés avec un lipide suivant un protocole déjà décrit suite à des travaux de notre équipe, et dont les étapes de purification ont été améliorées afin d obtenir des ATC les plus purs possible (90% de pureté molaire) ; l utilisation de ces ATC fonctionnels pour la synthèse de polymères a fonctionnels, et enfin, le couplage covalent, rapide et efficace, de chromophores en position latérale. Il a été mis en évidence que les ATC lipidiques permettent un très bon contrôle de la copolymérisation des monomères NAM et NAS. L utilisation de la composition azéotropique pour ce couple de monomère permet également d obtenir des chaînes polymère de microstructure très contrôlée et présentant des valeurs de Mn comprises entre 5 900 et 33 200 g.mol-1. Les propriétés optiques des bio-conjugués ont été déterminées, ce qui a permis de mettre en évidence que ces propriétés, et notamment le rendement quantique de fluorescence, sont très sensibles à la structure des bio-conjugués synthétisés. Tous les bio-conjugués présentent des brillances améliorées (jusqu à 13 000 M-1.cm-1 dans l eau et 50 0000 M-1.cm-1 dans CHCl3) par rapport à celle du chromophore. La capacité des bio-conjugués à interagir avec les bicouches lipidiques a été mise en évidence à travers l utilisation de systèmes modèles (SUVs, LUVs et GUVs). Enfin, les évaluations biologiques réalisées ont montré à la fois une absence de cytotoxicité des bio-conjugués et une capacité de ces derniers à être internalisés rapidement (< 10 min) au sein de différentes lignées de cellules vivantes.The aim of this study is to synthesize new far-red emitting fluorescent Lipid-Polymer conjugates, consisting of a polymer chain bearing both multiple fluorophores in lateral position and a lipid at one chain-end. These conjugates are based on an hydrophilic, reactive, flexible and controlled poly(N-acryloylmorpholine-co-N-acryloxysuccinimide) copolymer synthesized by the RAFT process. Multiple far-red emitting fluorophores were bound on the reactive copolymer in lateral position. The strategy used in this study consists of three different steps: Chain Transfer Agents (CTA) functionalized with a lipid were synthesized following a protocol already described in our team, the purity of these CTA was improved (90% molar purity); the use of these CTA for the synthesis of a functional polymers, and finally, the very efficient covalent binding of fluorophores in lateral position. We showed that the lipid-CTA enable a very good control of the NAM/NAS copolymerization. The azeotropic composition enables the synthesis of polymer chains with a controlled composition and with Mn values varying from 5 900 to 33 200 g.mol-1. The optical properties of the bio-conjugates were determined, and we showed that these properties (the fluorescence quantum yield especially) are structure sensitive. All of them show an improved brightness (13 000 M-1.cm-1 in water and 50 000 M-1.cm-1 in CHCl3) compared to the brightness of the free fluorophore. The ability of the bio-conjugates to interact with lipid bilayers was proved using model systems (SUVs, LUVs and GUVs). Finally, biological evaluations showed both an absence of cytotoxicity and an ability of the conjugates to be quickly internalized in leaving cells (< 10 min).VILLEURBANNE-DOC'INSA-Bib. elec. (692669901) / SudocSudocFranceF

Conjugués polymère-chromophores biphotoniques greffés sur des nanoparticules d'or comme sondes fluorescentes pour la bioimagerie et la photothérapie dynamique

La photothérapie dynamique (PTD) est un traitement alternatif du cancer qui nécessite l utilisation de chromophores (photosensibilisateurs) capables d induire la mort cellulaire suite à une irradiation lumineuse. Les nanoparticles d or (AuNP), grâce à leur phénomène de résonance plasmon localisée, peuvent exalter les propriétés photophysiques des chromophores localisés à leur surface. L utilisation d une excitation biphotonique, dans le proche infrarouge, peut être utilisée pour améliorer l action thérapeutique (PTD) ou diagnostique (imagerie de fluorescence) des chromophores en augmentant la profondeur de pénétration dans les tissus et la résolution tridimensionnelle de la microscopie biphotonique.Lors de ce travail, l élaboration de nouvelles nanoparticules hybrides est proposée, présentant des applications potentielles en bioimagerie (sondes brillantes) et comme photosensibilisateurs pour la PTD. Ces nanoparticules sont composées d un cœur d or sur lequel sont greffés des conjugués polymère-chromophores biphotoniques. La stratégie de synthèse a consisté à: i) synthétiser des conjugués polymère-chromophores biphotoniques solubles dans l eau; ii) les greffer de manière orientée à la surface des AuNP. La synthèse des conjugués polymère-chromophores hydrosolubles on été synthétisés via le couplage efficace de chromophores hydrophobes en position latérale des copolymères P(NAM-co-NAS) bien-définis, obtenus par la techniques de polymérisation radicalaire contrôlée RAFT. Cette stratégie permet le contrôle à la fois de la longueur des chaînes polymère formées (2000 g.mol-1 < Mn plus < 37 000 g.mol-1) et du nombre de chromophores couplés par chaîne (de 1 à 21). Le greffage orienté de ces conjugués à la surface des AuNP a été mis en évidence (TEM, ATG) et les densités de greffage se sont avérées élevées (~0.5chaîne/nm ). Un des rôles de la chaîne polymère étant de contrôler la distance entre les chromophores et la surface des AuNP. Il a été mis en évidence que l augmentation de la longueur de chaine des conjugués induisait, outre une augmentation de la couronne greffée (par MET) sur les AuNP, une augmentation de l émission de fluorescence de ces conjugués polymère-chromophores. Enfin, les propriétés biologiques des conjugués avant et après greffage sur les AuNP ont été évaluées in cellulo, mettant en valeur leur potentiel pour des applications thérapeutiques et diagnostiques.Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment of cancer requiring the use of chromophore molecules (photosensitizers), which can induce cell death after light excitation. Gold nanoparticles (AuNP), exhibiting localized Surface Plasmon Resonance, can enhance the photophysical response of chromophores located in their vicinity, and thus improve their therapeutic action. Moreover, the use of highly localized two-photon chromophores (photosensitizers and fluorophores), capable to undergo a localized excitation by light in the Near InfraRed region, should increase the penetration depth into tissues, thus improve the treatment efficiency (by PDT) and the imaging (by fluorescence microscopy) of cancer tissues.In this work, we describe the elaboration of water-soluble hybrid nano-objects for PDT and fluorescence bioimaging applications, composed of two-photon chromophore-polymer conjugates grafted onto gold nanoparticles. In order to obtain these nano-objects we follow a multistep strategy: i) the synthesis of a well-defined water-soluble chromophore-polymer conjugates; ii) the end-group oriented grafting of chromophore-polymer conjugates onto 20 nm AuNP. The coupling of hydrophobic two-photon chromophores on linear water-soluble copolymer chains (poly(N-acryloylmorpholine-co-N-acryloxysuccinimide)), obtained by controlled/living RAFT polymerization, resulted in well-defined water-soluble chromophore-polymer conjugates, with different polymer lengths (2000 g.mol-1 < Mn < 37 000 g.mol-1) and architectures (random or block), and a controlled number of chromophores per chain (varying between 1 and 21). Their grafting onto 20 nm AuNP gave water-soluble hybrid nano-objects with high grafting densities (~0.5 chains/nm ). The role of the polymer chain being to tune the distance between chromophores and AuNP surface, we have evidenced the increase in the polymer corona thickness of grafted AuNP (estimated by TEM) with the increasing polymer Mn, corroborating with the corresponding distance-dependent fluorescence properties of those. Finally, the in cellulo biological properties of two-photon chromophore-polymer conjugates, before and after grafting onto AuNP, have been investigated, highlighting their potential for two-photon bioimaging and PDT applications.VILLEURBANNE-DOC'INSA-Bib. elec. (692669901) / SudocSudocFranceF

Dye-labelled polymer chains at specific sites: Synthesis by living/controlled polymerization

International audienceDye-labelled polymer chains are extremely useful in many fields, such as optical imaging, signal amplification in biological diagnostics, light-harvesting and photochromic materials as well as in fluorescence studies about intra- and inter-molecular polymer chain associations, conformations and dynamics of polymer chains. However, in many cases, it is particularly useful that the dye is localized at a specific site, such as the chain-end or the junction between blocks. With the development of living/controlled polymerization techniques, end- and junction-functionalized polymers can be prepared with controlled molecular weights from a huge variety of monomers. This review highlights the state of the art in the strategies leading to one and only one precisely localized dye per polymer chain. Such dye can be introduced at three different steps of the polymerization: i) at the very beginning via the initiator or a chain transfer agent, ii) during polymerization via a functional monomer or a quencher, or iii) after polymerization via covalent binding of a dye-derivative

A detailed kinetic study of the RAFT polymerization of a bi-substituted acrylamide derivative: influence of experimental parameters

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Synthesis of N-acryloxysuccinimide copolymers by RAFT polymerization, as reactive building blocks with full control of composition and molecular weights

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Study of the RAFT Polymerization of a Water-Soluble Bisubstituted Acrylamide Derivative. 1. Influence of the Dithioester Structure

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MALDI-TOF MS Investigation of the RAFT Polymerization of a Water-Soluble Acrylamide Derivative

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Fluorescence Anisotropy of Hydrophobic Probes in Poly(N-decylacrylamide)-block-poly(N,N-diethylacrylamide) Block Copolymer Aqueous Solutions: Evidence of Premicellar Aggregates

International audienceFluorescent probes, coumarin 153 (C153) and octadecylrhodamine B (ORB), were used to study the self-assembly in water of poly(N-decylacrylamide)-block-poly(N,N-diethylacrylamide), (PDcA(11)-block-PDEA(295); M-n = 40 300 g mol(-1), M-w/M-n = 1.01). From the variation of both the fluorescence intensity and the solvatochromic shifts of C153 with polymer concentration, the critical micelle concentration (CMC) was determined as 1 8 +/- 0.1 mu M On the other hand, steady-state anisotropy measurements showed the presence of premicellar aggregates below the CMC Time-resolved fluorescence anisotropy evidenced that ORB is located in the premicellar aggregates and the micelle core, while C153 is partitioned between the aggregates and the water phase The micelle core contains both semicrystalline and amorphous regions In the semicrystalline regions the probes cannot rotate, while in the amorphous regions the rotational correlation times correlate well with the hydrodynamic volume of the probes. The amorphous region of the micelle core is relatively fluid, reflecting the large free-volume accessible to the probes