Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

International audienceFast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time

Vaccination with human anti-trastuzumab anti-idiotype scFv reverses HER2 immunological tolerance and induces tumor immunity in MMTV.f.huHER2(Fo5) mice

International audienceINTRODUCTION: Novel adjuvant therapies are needed to prevent metastatic relapses in HER2-expressing breast cancer. Here, we tested whether trastuzumab-selected single-chain Fv (scFv) could be used to develop an anti-idiotype-based vaccine to inhibit growth of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo through induction of long-lasting HER-specific immunity. METHODS: BALB/c mice were immunized with anti-trastuzumab anti-idiotype (anti-Id) scFv (scFv40 and scFv69), which mimic human HER2. Their sera were assessed for the presence of HER2-specific Ab1' antibodies and for their ability to reduce viability of SK-OV-3 cells, a HER2-positive cancer cell line, in nude mice. MMTV.f.huHER2(Fo5) transgenic mice were immunized with scFv40 and scFv69 and, then, growth inhibition of spontaneous HER2-positive mammary tumors, humoral response, antibody isotype as well as splenocyte secretion of IL2 and IFN-γ were evaluated. RESULTS: Adoptively-transferred sera from BALB/c mice immunized with scFv40 and scFv69 contain anti-HER2 Ab1' antibodies that can efficiently inhibit growth of SK-OV-3 cell tumors in nude mice. Similarly, prophylactic vaccination with anti-Id scFv69 fully protects virgin or primiparous FVB-MMTV.f.huHER2(Fo5) females from developing spontaneous mammary tumors. Moreover, such vaccination elicits an anti-HER2 Ab1' immune response together with a scFv69-specific Th1 response with IL2 and IFN-γ cytokine secretion. CONCLUSIONS: Anti-trastuzumab anti-Id scFv69, used as a therapeutic or prophylactic vaccine, protects mice from developing HER2-positive mammary tumors by inducing both anti-HER2 Ab1' antibody production and an anti-HER2 Th2-dependent immune response. These results suggest that scFv69 could be used as an anti-Id-based vaccine for adjuvant therapy of patients with HER2-positive tumors to reverse immunological tolerance to HER2

Évaluation du potentiel thérapeutique de l'anticorps recombinant chimère anti-CD4 13B8.2 dans les hémopathies malignes CD4+

L'immunothérapie passive est une stratégie thérapeutique majeure dans le traitement de nombreux cancers. Disposant au laboratoire de l'anticorps monoclonal anti-CD4 13B8.2, nous avons souhaité évaluer son potentiel thérapeutique dans les hémopathies malignes CD4+. Nous avons procédé à la chimérisation et à la production de l'anticorps recombinant 13B8.2 en système Baculovirus / cellules d'insecte afin d'évaluer ses propriétés anti-tumorales in vitro et in vivo dans un modèle murin. Dans un second axe, nous avons tenté une amélioration de l'anticorps via une augmentation de son affinité par une stratégie d'analyse innovante. L'anticorps recombinant 13B8.2 a démontré une activité anti-tumorale intéressante à travers divers mécanismes d'action des anticorps et son développement préclinique in vivo se poursuit actuellement. Par ailleurs, la stratégie d'amélioration de l'anticorps pourrait conduire à l'obtention de nouvelles molécules améliorées.MONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Compréhension des mécanismes d'action de l'anticorps recombinant 13B8.2 par l'analyse de la dynamique membranaire

L anticorps recombinant anti-CD4 13B8.2, breveté par l équipe Modulation Moléculaire, utilisé dans le cadre du traitement de tumeurs hématopoïétiques CD4+ rares, a démontré des capacités de lyse dépendante du complément (CDC) et d inhibition de la prolifération cellulaire. Cependant les modalités qui amènent à ces effets biologiques restent inexpliquées. C est pourquoi, basés sur les études menées sur le Rituximab anti-CD20 et dans le but de mieux comprendre les mécanismes d action de l anticorps 13B8.2, nous nous sommes intéressés à la réorganisation membranaire au niveau des rafts lipidiques suite au traitement par l anticorps. Les rafts lipidiques étant le siège des premiers événements qui amènent à la mise en place de voie de signalisation, la visualisation de la réorganisation de ces fractions a été l élément clef de notre étude. Nous avons donc tenté (1) d appréhender la réorganisation des rafts après traitement par l anticorps, (2) d identifier le flux moléculaire associé en relation avec les effets biologiques induits par l anticorps. Cette étude nous a permis de démontrer que les effets biologiques de l anticorps recombinant 13B8.2 passent par une réorganisation protéique et lipidique au niveau des rafts lipidiques. rIgG1 13B8.2 permet l accumulation de la molécule CD4 dans les rafts lipidiques alors que la protéine ZAP-70 et ses cibles sous-jacentes SLP-76, Vav-1 et PLCg1 en sont exclues. Par des jeux de phosphorylations/déphosphorylations ceci amène à l inhibition des voies activatrices dans la prolifération cellulaire. De plus, rIgG1 13B8.2 induit une augmentation de l activité de la sphingomyélinase acide, conduisant à l accumulation de céramides dans la cellule qui ont eux aussi des effets anti-prolifératifs. Cette meilleure connaissance de la réorganisation de la membrane, permettra de dégager de nouvelles cibles pertinentes et d envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à moduler le flux membranaire.MONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocSudocFranceF

Rôle de l'adaptateur protéique carma1 dans le mécanisme d'action de l'anticorps recombinant anti-cd4 13b8.2

L'anticorps recombinant anti-CD4 13B8.2 a démontré des capacités de lyse dépendante du complément (CDC) et d'inhibition de la prolifération cellulaire dans le cadre du traitement des tumeurs hématopoïétiques CD4+. Bien qu'il ait été démontré que son action antiproliférative passe par une modulation du facteur de transcription NF-(kappa)B, les mécanismes précis y conduisant restent encore inexpliqués. Au sein du laboratoire, de précédentes études ont démontré que l'anticorps anti-CD4 13B8.2 induit une réorganisation et une modulation des protéines dans les rafts, en y concentrant le CD4 et en y excluant les protéines ZAP70, SLP76, PLC(nu)1 et Vav1. Nous avons tenté d'expliquer les mécanismes qui participent à la modulation des protéines au sein des microdomaines membranaires lipidiques, et nous proposons que la voie de signalisation Carma1 soit impliquée dans les effets observés sur le facteur de transcription NF-(kappa)B. Cette étude démontre que les effets biologiques de l'anticorps recombinant 13B8.2 passent par une modulation de la voie Carma1, Bcl10, MALT1. L'anticorps 13B8.2 induit une réorganisation de ces protéines en dehors des microdomaines membranaires lipidiques avec une dissociation du complexe qui ne peut plus transmettre la signalisation conduisant à l'activation de NF-(kappa)B. Nous avons également mis en évidence que les réorganisations protéiques au niveau de la membrane, induites par l'anticorps anti-CD4 13B8.2 s'accompagnent d'une modulation des espèces lipidiques des microdomaines. Ainsi, nous observons une augmentation du niveau des acides gras de type C18 :0, et une augmentation de l'activité d'une sphingomyelinase acide qui conduit à une augmentation du taux de céramide. Parallèlement l'augmentation de céramide, induite par une sphingomyelinase bactérienne induit la réorganisation de ZAP70 hors des microdomaines, de façon comparable à l'anticorps 13B8.2. Cette meilleure connaissance des mécanismes de signalisation de l'anticorps anti-CD4 13B8.2, permettra de dégager de nouvelles approches thérapeutiques en vue de la modulation de la prolifération des cellules T et de leur sensibilisation à la chimiothérapie. Ce travail ouvre la voie à des possibilités de thérapies ciblant les microdomaines lipidiques.The recombinant anti-CD4 antibody 13B8.2 demonstrated capabilities complement dependent lysis (CDC) and inhibition of cell proliferation in the treatment of hematopoietic tumors CD4 +. Although it has been demonstrated that its antiproliferative activity through modulation of transcription factor NF-kB, the precise mechanisms leading to them remain unexplained. Within the laboratory, previous studies have shown that anti-CD4 13B8.2 induced a reorganization and modulation of proteins in rafts by concentrating CD4 and by excluding proteins ZAP70, SLP76, Vav1 and PLC(nu)1 . We tried to explain the mechanisms involved in the modulation of proteins within lipid microdomains, and we propose that the signaling pathway is involved in Carma1 observed effects on the transcription factor NF-kB. This study demonstrates that the biological effects of recombinant antibody 13B8.2 pass through a modulation of the channel Carma1, Bcl10, MALT1. 13B8.2 antibody induces a reorganization of these proteins outside the lipid membrane microdomains with a dissociation of the complex that can no longer transmit signals leading to activation of NF-kB. We also demonstrated that the protein reorganization at the membrane induced by anti-CD4 13B8.2 accompanied by modulation of lipid microdomains species. Thus, we see an increased level of fatty acids like C18: 0, and increased activity of acid sphingomyelinase leads to an increased rate of ceramide. Parallel increase of ceramide, induced by bacterial sphingomyelinase induced reorganization of ZAP70 outside microdomains similarly to the antibody 13B8.2. A better understanding of signaling mechanisms of the anti-CD4 13B8.2, will identify new therapeutic approaches for modulating the proliferation of T cells and their sensitization to chemotherapy. This work paves the way for potential therapies targeted to lipid microdomains.MONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocSudocFranceF

Etude de ligands de la molécule CD4 dérivés de l'anticorps monoclonal 13B8.2

La molécule CD4 joue un rôle prépondérant dans l'initiation de la réponse immunitaire en stabilisant la formation de la synapse immunologique. CD4 est également connu comme le récepteur primaire du virus de l'immunodéficience humaine. Ces deux événements participent à de nombreuses pathologies telles que les désordres autoimmuns, le rejet de greffe ou l'infection par VIH. En ce sens, la molécule CD4 est une cible thérapeutique majeure. Le développement des biotechnologies et surtout des immunothérapies a permis de générer une nouvelle classe de molécules thérapeutiques: les anticorps anti-CD4. L'anticorps monoclonal 13B8.2 est un anticorps anti-CD4 d'origine murine dirigé contre la région CDR3-/ike du domaine Dl de la molécule CD4. Cet anticorps a démontré des capacités d'inhibition de la prolifération virale et des réponses cellulaires CD4-dépendantes qui l'ont conduit en phases cliniques I1II dans le cadre du traitement du SIDA. Avec pour objectif le développement de cet anticorps vers une molécule d'intérêt pharmaceutique, nous nous sommes tout d'abord intéressés à la caractérisation des mécanismes moléculaires régissant son interaction avec CD4. Pour cela nous avons tout d'abord identifié par l'approche Spot de synthèse peptidique multiple sur membrane seize résidus des domaines variables de l'anticorps potentiellement impliqués dans l'interaction avec CD4. Parmi ces résidus, onze se sont avérés être effectivement critiques par mutagénèse dirigée du paratope de l'anticorps. Ensuite, nous avons cherché à préciser le mode d'action de l'anticorps 13B8.2 en explorant un mécanisme fonctionnel controversé: la dimérisation / oligomérisation de la molécule CD4. Ce mécanisme est inhibé par l'anticorps 13B8.2. Dans un second temps, nous avons caractérisé puis étudié deux ligands de la molécule CD4 dérivés de l'anticorps 13B8.2 : le fragment Fab chimérique homme/souris exprimé par le système Baculovirus, et des séquences peptidiques dérivées du paratope de l'anticorps, ou PDP. Ces molécules présentent des activités de liaison à CD4 et des propriétés biologiques similaires à celles de l'anticorps parental. Forts de ces résultats, nous envisageons le développement d'une nouvelle génération de molécules améliorées susceptibles d'être de véritables candidats-médicaments dans des indications thérapeutiques aussi variées que les pathologies autoimmunes, le rejet de greffe ou certains cas d'infection par VIH.MONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocSudocFranceF

Anticorps anti-CD4 et thérapie

MONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocSudocFranceF

Peritoneal macrophages from C57BL/6 mice orally immunized with Toxoplasma gondii antigens in association with cholera toxin possess an enhanced ability to inhibit parasite multiplication

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