Organización del citoesqueleto de actina en las barreras celulares de la córnea y su respuesta al estrés. Búsqueda de biomarcadores de queratocono

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 08-03-2025Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 08-09-2025La córnea, como la primera lente del sistema ocular, desempeña un papel crucial en la salud visual. La queratoplastia, el trasplante más común, destaca la necesidad de comprender mejor el impacto del cultivo y almacenamiento en biobancos en las córneas humanas. Compuesta por un epitelio externo, un estroma y una monocapa endotelial interna, la córnea requiere la función de barrera de su endotelio para mantener la transparencia del tejido, especialmente bajo condiciones subóptimas como patologías corneales, envejecimiento y trasplantes. La primera parte de la investigación se centra en la caracterización de la organización celular del endotelio corneal y las adaptaciones estructurales durante el almacenamiento para trasplante. Utilizando microscopía confocal de alta resolución y ratones como modelo, se observó que las células endoteliales corneales murinas, sometidas a la curvatura del tejido y la presión del humor acuoso, presentan una organización distintiva. El dominio apical es poligonal, con uniones intercelulares estrechas y adherentes conectadas a un anillo de actina filamentosa prominente. En contraste, el dominio basolateral forma contactos intercelulares sin uniones estrechas, con bajo contenido de F-actina y morfología ondulada con protrusiones que se imbrican con las células vecinas. Desde las uniones apicales poligonales, emergen haces de F-actina radial que convergen debajo del núcleo, denominadas puntos SFC (Subnuclear F-actin convergence), ricos en actomiosina, sugiriendo una zona de contracción mediada por actina. El análisis detallado de la F-actina y las proteínas conectoras de las uniones intercelulares, ZO-1 y α-catenin, reveló que el cultivo de córneas en el medio de trasplante TissueC, induce una reorganización transitoria de las regiones SFC, aumento significativo de actomiosina y, por ende, de la contractilidad celular. La inyección de vectores lentivirales en el humor acuoso de ratones permitió expresar proteínas fluorescentes in vivo y analizar la dinámica de actomiosina y uniones intercelulares ex vivo. Estos resultados sugieren una conexión entre las uniones intercelulares, el citoesqueleto de actomiosina y el núcleo. El análisis de componentes del complejo LINC, que conecta la pared nuclear con el citoesqueleto de actina citoplásmico, mediante la expresión de un vector lentiviral inducible del dominante negativo de nesprina-2, DN-KASH, alteró las uniones intercelulares corneales. Además, en córneas de un modelo murino de progeria, la expresión de progerina, una proteína mutante de la pared nuclear que causa envejecimiento acelerado, afectó el citoesqueleto de actina endotelial y las uniones intercelulares. En conjunto, estos resultados sugieren que alteraciones patológicas en la pared nuclear alteran la función de barrera del endotelio de córnea. A diferencia del endotelio, el epitelio de córnea regenera fácilmente y es accesible para análisis moleculares. En colaboración con Cornea Project S.L en este doctorado industrial, en la segunda parte de esta investigación se identificaron biomarcadores específicos en el epitelio de córnea humana para el diagnóstico temprano y pronóstico del queratocono. Cambios de expresión en seis genes humanos permitieron generar un clasificador para la enfermedad en sus fases iniciales basado en el análisis de tres genes, indicando un nuevo método potencial para el diagnóstico temprano o pronóstico de esta patologí

Generation and characterization of a human iPSC line (UAMi004-A) from a patient with propionic acidemia due to defects in the PCCB gene

A human induced pluripotent stem cell (iPSC) line was generated from fibroblasts of a patient with propionic acidemia that has a homozygous mutation (c.1218_1231del14ins12 (p.G407 fs)) in the PCCB gene. Reprogramming factors OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC were delivered using a non-integrative method based on the Sendai virus. Once established, iPSCs have shown full pluripotency, differentiation capacity and genetic stability. The generated iPSC line represents a useful tool to study the pathomechanisms underlying the deficiency.Spanish Ministry of Economy and Competitiveness and European Regional Development Fund. The authors thank INDEPF (Instituto de investigación y desarrollo social de enfermedades poco frecuentes), the Cytogenetic unit from Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) and Mar Álvarez for their excellent technical assistance. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa receives an institutional grant from Fundación Ramón Areces

Generation and characterization of a human iPSC line (UAMi004-A) from a patient with propionic acidemia due to defects in the PCCB gene

A human induced pluripotent stem cell (iPSC) line was generated from fibroblasts of a patient with propionic acidemia that has a homozygous mutation (c.1218_1231del14ins12 (p.G407 fs)) in the PCCB gene. Reprogramming factors OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC were delivered using a non-integrative method based on the Sendai virus. Once established, iPSCs have shown full pluripotency, differentiation capacity and genetic stability. The generated iPSC line represents a useful tool to study the pathomechanisms underlying the deficiencyResearch reported in this work was funded by Grant PAF107 from the Propionic Acidemia Foundation and by grant SAF2016-76004-R from Spanish Ministry of Economy and Competitiveness and European Regional Development Fund. The authors thank INDEPF (Instituto de investigación y desarrollo social de enfermedades poco frecuentes), the Cytogenetic unit from Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas(CNIO) and Mar Álvarez for their excellent technical assistance. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa receives an institutional grant from Fundación Ramón Areces. ALM is a postdoctoral researcher of Comunidad Autónoma de Madrid (PEJD-2017-POST/BMD-3671). EABis a PhD student funded by the FPU program of the Spanish Ministry ofScience, Innovation and Universities (FPU15/02923

Corrigendum to “Generation and characterization of a human iPSC line (UAMi004-A) from a patient with propionic acidemia due to defects in the PCCB gene”

We have generated and characterized seven human induced pluripotent stem cell (iPSC) lines derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a single family, including unaffected and affected individuals clinically diagnosed with Autism Spectrum Disorder (ASD). The reprogramming of the PBMCs was performed using non-integrative Sendai virus containing the reprogramming factors POU5F1 (OCT4), SOX2, KLF4 and MYC. All iPSC lines exhibited a normal karyotype and pluripotency was validated by immunofluorescence, flow cytometry and their ability to differentiate into the three embryonic germ layers. These iPSC lines are a valuable resource to study the molecular mechanisms underlying ASDThis study was funded in part by the Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) project grants (GNT1044175 and GNT1098255) awarded to E.G.S, M.B.D, I.S and P.J.L. K.B is supported by an E.H. Flack Fellowship and P.J.L is supported by the Vincent Chiodo Foundation. Additional infrastructure funding to the Murdoch Children's Research Institute was provided by the Australian Government NHMRC Independent Research Institute Infrastructure Support Scheme and the Victorian Government's Operational Infrastructure Support Program. The MCRI iPSC Core Facility is supported by the Stafford Fox Medical Research Foundation. M.B and E.G.S are Research Fellows, and I.S is a Practitioner Fellow, of the NHMR