A Highly Stable Biocatalyst Obtained from Covalent Immobilization of a Non-Commercial Cysteine Phytoprotease

In this work, araujiain (enzymatic preparation obtained from the latex of Araujia hortorum fruits) was successfully immobilized on glyoxyl-agarose via multipoint covalent attachment. Thus, good efficiency of immobilization and high operational stability of immobilized enzyme were obtained. The activity of araujiain at alkaline pH was significantly improved after immobilization. In addition, immobilized araujiain also showed high activity and good stability, without significant loss in its activity, at temperatures between 37 and 60°C and in the presence of immiscible organic solvents. Immobilized araujiain also showed good performance in a mixture of 50% ethyl acetate in buffer, used for peptide synthesis, with better results than when the free enzyme was used as catalyst. These results indicate that immobilized araujiain via multipoint covalent attachment can be highly stabilized and this method might be used for practical applications of araujiain in hydrolytic and synthetic processes.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

A Highly Stable Biocatalyst Obtained from Covalent Immobilization of a Non-Commercial Cysteine Phytoprotease

In this work, araujiain (enzymatic preparation obtained from the latex of Araujia hortorum fruits) was successfully immobilized on glyoxyl-agarose via multipoint covalent attachment. Thus, good efficiency of immobilization and high operational stability of immobilized enzyme were obtained. The activity of araujiain at alkaline pH was significantly improved after immobilization. In addition, immobilized araujiain also showed high activity and good stability, without significant loss in its activity, at temperatures between 37 and 60°C and in the presence of immiscible organic solvents. Immobilized araujiain also showed good performance in a mixture of 50% ethyl acetate in buffer, used for peptide synthesis, with better results than when the free enzyme was used as catalyst. These results indicate that immobilized araujiain via multipoint covalent attachment can be highly stabilized and this method might be used for practical applications of araujiain in hydrolytic and synthetic processes.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Identificación de inhibidores peptídicos de proteasas con potencial aplicación biomédica obtenidos a partir de <i>Solanum tuberosum</i> subespecie <i>andígena</i> variedad imillanegra (papa andina)

Introducción: Los inhibidores de proteasas (IPs) tienen importantes aplicaciones en la biomedicina, la biotecnología y el diagnóstico. Una regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología humana, por esto muchas proteasas se han convertido en importantes dianas biomédicas, protagonizando casi la mitad de los fármacos del mundo para el tratamiento de patologías. Estudios con células cancerosas indicaron que algunos inhibidores actúan sobre diferentes proteasas serínicas que están implicadas en las cadenas de señalización de células tumorales, impidiendo su proliferación. Objetivos: El objetivo de este trabajo es el aislamiento, purificación e identificación de nuevos inhibidores de proteasas obtenidos a partir de tubérculos de Solanum tuberosum subespecie andígena variedad Imillanegra, provenientes de la región andina, para su potencial aplicación en el desarrollo de nuevos biofármacos. Materiales y Métodos: La combinación de la espectrometría de masas junto a la inmovilización de proteasas ha logrado desarrollar una técnica rápida y versátil “High-throughput screening” (HTS) que permite realizar un screening rápido para la identificación molecular. Esta metodología ha permitido identificar IPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. Resultados: Se encontraron nuevos inhibidores de tripsina y subtilisina (serinproteasas) que fueron caracterizados bioquímicamente. Conclusiones: Los procesos de purificación mediante inmovilización enzimática han sido claves para el aislamiento de inhibidores. Estas biomoléculas abren un camino potencial para el desarrollo de tratamientos adecuados para diversas enfermedades. Esto pudiera producir grandes avances diagnósticos y terapéuticos, lo que demuestra la importancia de estas tecnologías para la identificación y caracterización de nuevos IPs.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Efectos biológicos de inhibidores de proteasas en alimentos

Los productos naturales constituyen una de las mayores fuentes para el desarrollo de alimentos, debido a su diversidad química y a que se les supone una toxicidad inicial limitada al encontrarse en seres vivos. Entre estos productos se encuentran los inhibidores de proteasas (IPs). Las fuentes vegetales de IPs han sido escasamente exploradas y tienen la ventaja de su extraordinaria riqueza y diversidad. Tienen menor costo de obtención y procedimientos muy sencillos, si se comparan con los procedimientos de obtención por síntesis química. Seguramente el mayor incentivo para la búsqueda de nuevos IPs es que el control de la proteólisis de las proteasas propias del alimento o actividad antimicrobiana presente en el mismo representa una herramienta valiosa a la hora de conservar alimentos (Ayensa, 2002; Jin-Young et al., 2005). La combinación de la espectrometría de masas junto a la inmovilización de proteasas ha logrado desarrollar una técnica rápida y versátil “High-throughput screening” (HTS) que permite realizar un screening rápido para la identificación de moléculas. Esta metodología ha permitido identificar IPs en extractos heterogéneos que fueron posteriormente purificados y caracterizados por métodos convencionales. Por medio de IF/MALDI TOF/MS, se pudo identificar nuevos IPs obtenidos a partir de Solanum tuberosum subespecie andígena de la variedad Imillanegra (papa andina) utilizando para su purificación microcolumnas de tripsina inmovilizada en soportes de glioxil agarosa. Con todo esto se propone (aprovechando también nuestra experiencia en el estudio bioquímico y estructural de las proteínas, sus aplicaciones biotecnológicas y la infraestructura disponible en nuestro laboratorio) continuar con la detección, purificación, caracterización bioquímica y aplicación de técnicas bioinformáticas sobre nuevos inhibidores de proteasas que demuestren posibilidades de potenciales aplicaciones en el desarrollo de nuevas sustancias utilizadas en la conservación de alimentos.Facultad de Ciencias Exacta

Nuevos inhibidores de proteasas con potencial utilización en la industria alimentaria obtenidos a partir de papa andina

En los últimos años, la biotecnología y sus aplicaciones industriales han experimentado grandes logros en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria y farmacéutica. El empleo de productos vegetales para la conservación de alimentos es uno de los procesos que busca actualmente la “química verde” para tratar carnes, vegetales y productos envasados en general, para prolongar la vida útil del alimento. Dentro de estos productos bioactivos se encuentran los inhibidores de metalocarboxipeptidasas los cuales, entre otras acciones, inhiben el crecimiento bacteriano o fúngico. La regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología de los microorganismos, como ser la producción de toxinas, entre otras, por esto la actividad de muchas proteasas se encuentra bajo estudio intensivo, ya que los inhibidores de proteasas (IP) son un tipo de regulador de las mismas. La tecnología y la creación de instrumentos para una fina purificación como la inmovilización de enzimas y la espectrometría de masas es lo que ha permitido detectar y caracterizar componentes individuales como los inhibidores de proteasas con posibles propiedades conservantes del alimento. Por otra parte, cabe destacar además que, en el caso de los inhibidores peptídicos de origen vegetal, son mínimos los estudios referidos al material botánico de la flora Argentina. Dada la gran biodiversidad vegetal existente en nuestro país resulta de sumo interés la implementación de una búsqueda de nuevas moléculas naturales capaces de modificar o modular la actividad biológica de proteasas y microorganismos que estén involucradas en la conservación de alimentos o en funciones nutricionales. En el presente trabajo se ha purificado y caracterizado un nuevo inhibidor de Carboxipeptidasa A de 4,3 KDa obtenido a partir de Solanum Tuberosum subespecie andigenum variedad Churqueña (Papa Andina). Los tratamientos térmicos del inhibidor muestran que conserva actividad luego de un proceso de 1 hora a 100°C.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Capacidad antimicrobiana de fitoproteasas autóctonas sobre cepas bacterianas patógenas de importancia clínica y alimentaria

Los productos naturales y las drogas relacionadas son usados en el tratamiento del 87% de las enfermedades que afectan al hombre inclusive en las infecciones bacterianas, en cáncer y en desórdenes inmunológicos. Es así que muchos países en desarrollo basan su medicina popular en compuestos obtenidos a partir de plantas. A diferencia de los animales, las plantas carecen de sistema inmunológico y la respuesta inmunitaria de ellas comprende mensajeros químicos sistémicos que se distribuyen por toda la planta. En los últimos años se ha reportado el aislamiento de diferentes tipos de proteínas vegetales con actividad antimicrobiana, entre ellas quitinasas, β-1,3-glucanasas, defensinas, tioninas, inhibidores de proteasas e incluso enzimas proteolíticas (Rojas et al., 2006). En consecuencia, la búsqueda de nuevas fuentes de agentes antimicrobianos se hace imprescindible, dado el creciente aumento de la resistencia de microorganismos a los antibióticos tradicionales. En este contexto, la investigación en compuestos biológicamente activos de origen natural resulta de gran interés. Se ha observado que algunas proteasas están involucradas en procesos de inhibición del crecimiento bacteriano (Guevara et al., 2004) y es por eso que el objetivo de este trabajo es determinar la capacidad antimicrobiana in vitro de dos endopeptidasas autóctonas frente a distintas cepas patógenas de importancia clínica y alimentaria. Se purificaron los extractos crudos de látex de frutos de Araujia hortorum y de frutos maduros de Salpichroa origanifolia. La actividad antimicrobiana de las fracciones purificadas fue ensayada sobre cepas seleccionadas de Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, Escherichia coli, Serratia marcescen y Kebsiella pneumoniae. El ensayo in vitro se realizó incubando las proteasas en medio de cultivo líquido (caldo tripteína soja) a 37ºC frente a las distintas cepas bacterianas. El seguimiento de la cinética de crecimiento bacteriano en ausencia o en presencia del compuesto antimicrobiano se realizó midiendo la turbidez a 650 nm durante 20 hs de incubación, en un espectrofotómetro GeneQuant. El porcentaje de inhibición se calculó como el cociente entre las mediciones de DO con y sin peptidasa. Como conclusión podemos afirmar que las endopeptidasas cisteínicas presentes en Araujia hortorum (araujaína) demostraron actividad antimicrobiana frente Salmonella enteritidis (90% de inhibición) y en menor grado frente a Escherichia coli (25%). En el caso de las aspartil peptidasas de Salpichroa origanifolia (salpichroína), se observó un 95% de inhibición frente a cepas de Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens y en menor grado de Escherichia coli (75%). Estos resultados podrían contribuir al desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos en el área de salud, además de tener aplicación en la industria de los alimentos y/o en el sector agronómico.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

A highly stable biocatalyst obtained from covalent immobilization of a non-commercial cysteine phytoprotease

In this work, araujiain (enzymatic preparation obtained from the latex of Araujia hortorum fruits) was successfully immobilized on glyoxyl-agarose via multipoint covalent attachment. Thus, good efficiency of immobilization and high operational stability of immobilized enzyme were obtained. The activity of araujiain at alkaline pH was significantly improved after immobilization. In addition, immobilized araujiain also showed high activity and good stability, without significant loss in its activity, at temperatures between 37 and 60°C and in the presence of immiscible organic solvents. Immobilized araujiain also showed good performance in a mixture of 50% ethyl acetate in buffer, used for peptide synthesis, with better results than when the free enzyme was used as catalyst. These results indicate that immobilized araujiain via multipoint covalent attachment can be highly stabilized and this method might be used for practical applications of araujiain in hydrolytic and synthetic processes.Fil: Obregon, Walter David. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biologicas. Laboratorio de Investigación de Proteinas Vegetales; ArgentinaFil: Cisneros, José Sebastián. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biologicas. Laboratorio de Investigacion de Proteinas Vegetales; ArgentinaFil: Ceccacci, Florencia. Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biologicas. Laboratorio de Investigacion de Proteinas Vegetales; ArgentinaFil: Quiroga, Evelina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico San Luis. Instituto de Física Aplicada; Argentin

Nuevos inhibidores de metalocarboxipeptidasas como potenciales drogas emergentes en biomedicina

El empleo de productos vegetales para la cura de enfermedades tales como el Cáncer, el SIDA y la Malaria, entre otras, puede ser una de las claves terapéuticas a utilizarse en el futuro. Dentro de estos productos bioactivos se encuentran los inhibidores de metalocarboxipeptidasas los cuales, entre otras acciones, inhiben la acción de la trombina en la cascada de coagulación constituyendo una importante droga en las terapias trombolíticas. La regulación precisa de la actividad proteolítica es esencial para la fisiología humana, por esto la actividad de muchas proteasas se encuentra bajo estudio intensivo, ya que los inhibidores de proteasas (IP) son un tipo de regulador de las mismas. La tecnología y la creación de instrumentos para una fina purificación es lo que nos puede permitir detectar los componentes individuales que contienen las propiedades curativas.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale