Effect of Ethylene-Insensitive Mutation etr2b on Postharvest Chilling Injury in Zucchini Fruit

Zucchini is a vegetable fruit that is very susceptible to postharvest chilling injury, and fruit ethylene production is correlated with chilling injury sensitivity, such that the more tolerant the cultivar, the lower is its ethylene production. It is expected that zucchini fruit with reduced sensitivity to ethylene would have a higher chilling injury tolerance. In this study, we compared the postharvest fruit quality of wild type and ethylene-insensitive mutant etr2b, in which a mutation was identified in the coding region of the ethylene receptor gene CpETR2B. Flowers from homozygous WT (wt/wt), mutant plants in homozygous (etr2b/etr2b) and heterozygous (wt/etr2b) were hand-pollinated, and all fruits were harvested with the same length, at about 8 days after pollination. After harvesting, fruit of each genotype was randomly divided in 3 batches of 12 fruits each (four replications with three fruits each), and then stored at 4 °C and 95% RH. At 0, 7, and 14 days after cold storage, each batch was used to assess ethylene production, respiration rate, weight and firmness loss, chilling injury, and oxidative stress metabolites. The results showed a lower chilling injury associated with lower cold-induced ethylene production in the mutant fruit, in comparison with the WT fruit. These data demonstrated that the ethylene-insensitive etr2b mutant fruit was more tolerant to chilling injury, confirming that basal ethylene in the still undamaged fruit could function as a modulator of post-harvest chilling injury. Moreover, the higher chilling tolerance of the etr2b mutant fruit was not associated with MDA content, but was concomitant with a reduction in the accumulation of hydrogen peroxide in the refrigerated mutant fruit

Role of ethylene and jasmonate on traits of agronomic interest in cucurbita pepo: a genomic approach.

Cucurbita pepo es un cultivo hortícola económicamente importante a nivel mundial. El control genético de los rasgos morfológicos y fisiológicos que afectan la producción y la calidad de los cultivos es esencial para desarrollar programas de fitomejoramiento que mejoren, no sólo la producción de los cultivos o su tolerancia a los estreses bióticos y abióticos, sino también, los rasgos relacionados con la calidad, como la partenocarpia. En zonas semiáridas, los estreses abióticos, como la salinidad, se están convirtiendo en factores cada vez más importantes afectando, el desarrollo vegetativo y reproductivo y la producción de los cultivos. El etileno (ET) tiene un papel relevante y contrastante en las respuestas de las plantas a los estreses ambientales. En esta tesis, hemos analizado los efectos sobre la tolerancia a la sal, de tres mutaciones de ganancia de función, etr1a, etr1b y etr2b, que afectan a los receptores de ET, CpETR1A, CpETR1B y CpETR2B de Cucurbita pepo. Se ha demostrado que los receptores de ET juegan un papel positivo en la tolerancia a la sal, mejorando la germinación, el establecimiento de plántulas y el posterior crecimiento vegetativo de las plantas. Los mutantes etr1b, etr1a y etr2b germinaron antes que WT bajo estrés salino y sus tasas de crecimiento en raíces y brotes, tanto en plántulas como en plantas, se vieron menos afectadas por la sal. Se encontró, que la respuesta de tolerancia a la sal en etr2b estaba asociada con una acumulación reducida de Na+ en brotes y hojas, así como una mayor acumulación de solutos compatibles, que incluyen; prolina, carbohidratos totales y compuestos antioxidantes. Además, varios genes que codifican transportadores de cationes monovalentes de membrana, como; intercambiadores de Na+/H+ y K+/H+ (NHX), antiportadores de salida de K+ (KEA), transportadores de alta afinidad de K+ (HKT) y transportadores de captación de K+ (KUP), también estaban altamente regulados por la salinidad en etr2b frente a WT. De acuerdo con ello, nuestros datos indican que la mayor tolerancia a la sal de etr2b está dirigida por la inducción de genes que excluyen el Na+ de los órganos fotosintéticos, al tiempo que mantienen la homeostasis de K+/Na+ y el ajuste osmótico. La mayor regulación positiva de los genes involucrados en la señalización de Ca2+ (CRCK) y la biosíntesis de ABA (NCED) en hojas de etr2b bajo estrés salino, nos indica que la función de los receptores de ET en la respuesta al estrés salino puede estar mediada por las vías de señalización de Ca2+ y ABA, siendo el ET un regulador negativo de la tolerancia a la sal en C. pepo. El ET es también el regulador clave de la expresión (ES) y el determinismo sexual (DS) en las especies monoicas de la familia Cucurbitaceae. Esta hormona, no sólo controla la proporción de flores masculinas y femeninas en la planta, sino también el mecanismo que hace que cada meristemo floral se determine como una flor femenina o masculina. Esto último se logra deteniendo el desarrollo del estambre o el carpelo en las primeras etapas del desarrollo de la flor. Hasta la fecha, se han descrito que muchos de los diferentes genes de biosíntesis y señalización de ET regulan los rasgos ES y DS en cucurbitáceas. Sin embargo, la interacción entre ET y otras hormonas en la regulación del desarrollo floral es poco conocida. En esta tesis hemos analizado un nuevo mutante de EMS en C. pepo que se ve afectado en DS. La mutación convierte las flores femeninas en hermafroditas e interrumpe la tasa de crecimiento y la maduración de los pétalos y carpelos, lo que retrasa la apertura de las flores femeninas, promoviendo el crecimiento de los ovarios y con ello, el desarrollo partenocárpico de los frutos. La re-secuenciación del genoma completo permitió la identificación de la mutación causal del fenotipo, como una mutación sin sentido (G > A) en la región codificante de CpACO1A, un gen que codifica, una enzima ACO tipo I, la cual, comparte una alta identidad con C. sativus CsACO3 y C. melo CmACO1. El llamado aco1a redujo la actividad de ACO y la producción de ET en diferentes órganos donde se expresa el gen y redujo la sensibilidad a ET en las flores. CpACO1A y otros genes DS, incluidos, CpACO2B, CpACS11A y CpACS27A, mostraron una regulación de retroalimentación por ET de manera específica y temporal en los tejidos. Se descubrió que el ET y la regulación de retroalimentación positiva de CpACO1A, CpACO2B, CpACS11A y CpACS27A son responsables de determinar el destino del meristemo floral hacia una flor femenina, al promover el desarrollo de los carpelos y detener el desarrollo de los estambres. Además de su papel como hormona DS, el contenido de hormonas en aco1a sugirieron, que el papel positivo de ET en la maduración de los pétalos y la apertura de las flores, puede estar mediado por la inducción de la biosíntesis de ácido jasmónico (JA), mientras que su papel negativo en el crecimiento de los ovarios y el cuajado de los frutos podría estar mediado por su efecto represivo sobre la biosíntesis de auxinas (IAA). En los últimos años, se ha descubierto que el JA es una hormona relevante en el desarrollo floral en numerosas especies, aunque, su función en el desarrollo floral de las cucurbitáceas y DS es desconocida. En esta tesis, se abordó la diafonía entre ET y JA en la regulación diferencial de la apertura de flores masculinas y femeninas y el desarrollo temprano de los frutos en Cucurbita pepo utilizando un nuevo mutante, lox3a, deficiente en JA, así como, los mutantes insensibles y deficientes en ET, aco1a y etr2b. La mutación EMS en lox3a suprimió la apertura de flores, tanto masculinas como femeninas, e indujo un desarrollo partenocárpico de los frutos. El análisis por BSA-seq y posterior mapeo fino, permitió la identificación de lox3a en el sitio de corte y empalme 5' del intrón 6 de CpLOX3A, un gen LIPOXIGENASA involucrado en la biosíntesis de JA. El contenido reducido de JA y la expresión disminuida de genes de biosíntesis (CpLOX3A, CpAOS1A y CpJAR1B) y señalización (CpJAZ1B, CpCOI1B y CpMYB21B) en flores masculinas y femeninas de lox3a, así como, el rescate del fenotipo lox3a mediante la aplicación externa de MeJA, demostraron que JA controla la elongación de pétalos y la apertura de las flores, así como, el aborto de los frutos en ausencia de fertilización. JA también rescató el fenotipo de los mutantes de ET, aco1a y etr2b, que son específicamente defectuosos en la apertura de las flores femeninas y el aborto de los frutos. Estos datos indican que el ET es inducido en las flores femeninas hacia la antesis, activando la producción de JA y promoviendo la apertura de la flor femenina y el aborto del ovario no fecundado. Dado que los ovarios de aco1a y etr2b retrasan su aborto hasta que las flores no alcanzan la apertura y el ovario de lox3a también aborta inmediatamente después de la apertura de la flor en respuesta a MeJA, proponemos, que la apertura de la flor puede actuar como un interruptor que desencadene el cuajado del fruto y desarrollo de los ovarios fertilizados, pero alternativamente, pueda inducir el aborto del ovario no fertilizado. Tanto el ET como el JA en los pétalos maduros y senescentes pueden servir como señales remotas que deciden el desarrollo alternativo del ovario y el fruto.Doctorado en Agricultura Protegida (RD99/11) (8901