Microbial profiling of a suppressiveness-induced agricultural soil amended with composted almond shells lead to isolation of new biocontrol agents

Vida et al., 2016. Microbial profiling of a suppressiveness-induced agricultural soil amended with composted almond shells lead to isolation of new biocontrol agents. Biological and integrated control of plant pathogens IOBC-WPRS Bulletin Vol. 117, 2016 pp. 140-143This study focused on the microbial profile present in an agricultural soil that becomes suppressive after the application of composted almond shells (AS) as organic amendments. The role of microbes in the suppression of Rosellinia necatrix, the causative agent of avocado white root rot, was determined after heat-treatment and complementation experiments with different types of soil. Bacterial and fungal profiles based on the 16S rRNA gene and ITS sequencing, the soil under the influence of composted almond shells revealed an increase in Proteobacteria and Ascomycota groups, as well as a reduction in Acidobacteria and Xylariales (where R. necatrix is allocated). Complementary to these findings, functional analysis by GeoChip 4.6 confirmed the improvement of a group of specific probes included in the “soil benefit” category was present only in AS-amended soils, corresponding to specific microorganisms previously described as potential biocontrol agents, such as Pseudomonas spp., Burkholderia spp. or Actinobacteria. Based in such data, a model for the microbial-based suppressiveness is proposed and further isolation of representative microorganisms were performed.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Deciphering the suppressive soil microbiota from an avocado crop

Comunicación en pósterDifferent strategies based on ecological principles have been approached in sustainable agriculture causing positive effects, including the induction of soil suppressiveness against a wide range of soilborne pathogens. Suppressiveness against the phytopathogenic fungus Rosellinia necatrix was observed after the application of composted almond shells in avocado crops. Previous works have analyzed the use of this traditional strategy and applied new microbial community analysis techniques in order to help in the identification of targeted sustainable agricultural strategies. These studies have focused on the microbial profile from an induced-suppressive soil where the soil microbiome had a proven essential role. Microbial profiles based on the 16S rRNA gene and ITS regions sequencing were analysed and an increase in Gammaproteobacteria and Dothideomycetes groups, as well as a reduction in Xylariales (where R. necatrix is allocated) were observed. These results led to the bacterial isolation of different groups of Gammaproteobacteria from this suppressive soil in order to identify new strains with biological control properties. Different characterization tests were performed, and a final selection of representative strains belonging to the genus Pseudomonas and related groups showed, all of them, plant disease protection abilities. Moreover, using previously described biological control agents against R. necatrix, a bacterial synthetic community have been design in order to improve the knowledge of the multitrophic interactions that occur during biological control process.This work was supported by Plan Nacional I+D+I (MINECO, Spain) (AGL2014-52518-C2-IR) and co-financed by FEDER funds (EU). C.Vida was supported by a PhD fellowship from the FPI program of MINECO. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Isolation, characterization and selection of Pseudomonas spp. as biological control agents from a suppressive soil

Bacterial profile from a suppressive soil against Rosellinia necatrix, fungal pathogen of avocado roots, were obtained by 16S rRNA gene sequencing. The results revealed a significant increase in the bacterial class of Gammaproteobacteria, especially in some antagonistic representatives of Pseudomonas spp. For this reason, a collection of 246 bacterial isolates was obtained from this suppressive soil in order to identify new strains with antifungal activity against this fungal phytopathogen. First, we performed an isolation on a selective medium for Pseudomonas-like microorganisms. Then, we used different characterization tests in order to analyse the bacterial collection, including the identification of the general metabolic profile of glucose, the profiling of antifungals produced, both the putative production of antifungal compounds and lytic exoenzymes, as well as the evaluation of traits related with beneficial effects on plants. A final selection of representative strains resulted in antifungal isolates belonging to the genus Pseudomonas and related groups. These selected strains were tested for plant protection by an in vivo experiment using avocado and wheat plants challenged by the pathogen R. necatrix, showing all of them an antifungal ability and plant disease protection.This work was supported by Plan Nacional I+D+I from MINECO (Spain) (AGL2014-52518-C2-IR) and co-financed by FEDER funds (EU). C.Vida was supported by a PhD fellowship from the FPI program of MINECO.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Genomic analysis of eight native plasmids of the phytopathogen Pseudomonas syringae

Comunicación a conferenciaThe pPT23A family of plasmids (PFPs) appears to be indigenous to the plant pathogen Pseudomonas syringae and these plasmids are widely distributed and widely transferred among pathovars of P. syringae and related species. PFPs are sources of accessory genes for their hosts that can include genes important for virulence and epiphytic colonization of plant leaf surfaces. Further understanding of the evolution of the pPT23A plasmid family and the role of these plasmids in P. syringae biology and pathogenesis, requires the determination and analysis of additional complete, closed plasmid genome sequences. Therefore, our main objective was to obtain complete genome sequences from PFPs from three different P. syringae pathovars and perform a comparative genomic analysis. In this work plasmid DNA isolation, purification by CsCl-EtBr gradients, and sequencing using 454 platform, were used to obtain the complete sequence of P. syringae plasmids. Different bioinformatic tools were used to analyze the plasmid synteny, to identify virulence genes (i.e. type 3 effectors) and to unravel the evolutionary history of PFPs. Our sequence analysis revealed that PFPs from P. syringae encode suites of accessory genes that are selected at different levels (universal, interpathovar and intrapathovar). The conservation of type IVSS encoding conjugation functions also contributes to the distribution of these plasmids within P. syringae populations. Thus, this study contributes to unravel the genetic basis of the role of PFPs in different P. syringae lifestyles.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Isolation, characterization and selection of bacterial isolates from a suppressive soil with beneficial traits to plants

Backgrounds This study focused on the characterization and selection of bacterial strains obtained from a suppressive soil displaying antifungal activity against the soilborne phytopathogenic fungi Rosellinia necatrix. Bacterial profile from this suppressive soil were first obtained by 16S rRNA gene sequencing, revealing a significant increase in the bacterial class Gammaproteobacteria, especially in some antagonistic representatives of Pseudomonas spp. Objectives To obtain and characterize a collection of 246 bacterial isolates obtained from this suppressive soil, in order to identify new strains with antifungal activity against fungal phytopathogens. Methods To obtain the bacterial collection, we performed an isolation on a selective medium for Pseudomonas-like microorganisms. Further characterization tests were used in order to analyse the bacterial collection, including identification of the general metabolic profile of glucose, the profiling of antifungals produced, including both the putative production of antifungal compounds and lytic exoenzymes, and the evaluation of traits related with beneficial effects on plants. Conclusions A final selection of representative strains resulted in antifungal isolates belonging to the genus Pseudomonas, but also some representatives of the genera Serratia and Stenotrophomonas. These selected strains were tested for plant protection by an in vivo experiment using avocado and wheat plants challenged by the pathogen R. necatrix, showing all of them an antifungal ability and plant disease protection. Pseudomonas-like strains isolated from suppressive soils constitute an excellent source for novel microbial biocontrol agents against soilborne fungal pathogens. This work was supported by grant AGL2014-52518-C2-1-R. Carmen Vida and Sandra Tienda are supported by a PhD fellowship from the FPI program of the Spanish Government.This work was supported by grant AGL2014-52518-C2-1-R. Carmen Vida and Sandra Tienda are supported by a PhD fellowship from the FPI program of the Spanish Government; Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Análisis de la comunidad microbiana de un suelo supresivo en el cultivo del aguacate

Comunicación oralLa podredumbre blanca de la raíz causada por el hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix, es uno de los problemas más graves del cultivo del aguacate en el área mediterránea. Desde hace años, el manejo integrado de la enfermedad ha incluido la aplicación de enmiendas orgánicas como estrategia para mejorar el estado fitosanitario de los suelos agrícolas. En trabajos anteriores, se demostró el efecto positivo que tenía la aplicación de cáscara de almendra compostada en el control biológico del patógeno, relacionado con los cambios inducidos en las propiedades fisicoquímicas y microbianas del suelo. En este trabajo, nos centramos en analizar el papel de la comunidad microbiana de estos suelos denominados suelos supresivos. Para ello, se llevaron a cabo ensayos “in vitro” frente a R. necatrix que mostraron que la adición de cáscara de almendra compostada al suelo, causa un aumento de la supresividad frente a R. necatrix asociada a la microbiota. El uso de técnicas de genómica molecular nos ha permitido conocer la composición y el potencial funcional (GeoChip®) de la microbiota de estos suelos. Concretamente, esta actividad supresiva era llevada a cabo por algunos grupos específicos de microorganismos que realizaban una actividad integrada. El aislamiento y caracterización de bacterias cultivables de la clase Gammaproteobacteria, mostró la capacidad de estos aislados para controlar el índice de enfermedad causado por el patógeno, utilizando diferentes estrategias de control biológico como la posible producción de compuestos antifúngicos, exoenzimas líticas o la promoción de crecimiento vegetal. Además, se ha diseñado un consorcio bacteriano artificial formado por representantes de esta clase de bacterias de suelo, descritos en trabajos anteriores como agentes de control biológico frente a R. necatrix, con el fin de profundizar en el conocimiento de los posibles mecanismos implicados en la supresividad, así como, en el patrón de colonización de raíz de este consorcio bacteriano artificial.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Señalización de Pseudomonas chlororaphis PCL1606 en la rizosfera durante las interacciones multitróficas

Comunicación oralPseudomonas chlororaphis PCL1606 es una rizobacteria, que muestra capacidad antagonista y actividad de biocontrol frente a diferentes hongos fitopatógenos de suelo, entre ellos Rosellinia necatrix, que produce la enfermedad denominada podredumbre blanca radicular en el aguacate. Entre otros factores, se ha demostrado que PCL1606 produce un compuesto antifúngico (2-hexil, 5-propil resorcinol o HPR), que resulta clave para el antagonismo y la actividad biocontrol contra R. necatrix. En este trabajo se aborda el estudio en detalle de los procesos de interacción que tienen lugar durante el biocontrol de PCL1606 frente a R .necatrix en la raíz de aguacate. Para ello, se realizará una aproximación mediante RNA-seq, y que revelará que RNA mensajeros están presentes en ese determinado momento, permitiendo la identificación de los genes que se expresan durante el proceso de interacción, y la posible función e implicación en el proceso. Para la puesta a punto de un modelo experimental de interacción sobre el que realizar análisis moleculares, se han iniciado los experimentos realizando análisis de RNA-seq sobre placas de medio de cultivo, que revelaron la inducción y represión de distintos genes de PCL1606 en presencia/ausencia de R. necatrix. Genes representativos seleccionados se emplean como controles para estimar, mediante experimentos qRT-PCR, las condiciones experimentales del ensayo sobre raíz de aguacate. Una vez validado el modelo experimental, se iniciará el estudio de las interacciones multitróficas que tienen lugar mediante análisis de RNA-seq a las distintas condiciones de ensayo. El resultado previsto contempla que el análisis de los genes que se induzcan/repriman en este proceso, aportarán información fundamental sobre la biología del agente de biocontrol y los procesos que tienen lugar durante las interacciones multitróficas en el biocontrol.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Supresividad y análisis de la comunidad microbiana de un suelo agrícola enmendado con cáscara de almendra

La podredumbre blanca radicular, causada por el hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix, es uno de sus problemas más graves del cultivo del aguacate en el área Mediterránea. Una de las estrategias de manejo de este cultivo incluye la aplicación de enmiendas orgánicas como estrategia para mejorar el estado fitosanitario de estos suelos agrícolas. En este trabajo, se evalúa la capacidad supresiva de suelos enmendados con cáscara de almendra compostada, y la implicación de la microbiota que se desarrolla en este suelo en dicha supresividad. Para ello, se llevaron a cabo ensayos de supresividad "in vitro", usando dos plantas diferentes, Persea americana (aguacate) y Triticum aestivum (trigo), ambas susceptibles a R. necatrix. Los resultados muestran que la adición de cáscara de almendra compostada al suelo estimula un efecto supresivo contra R. necatrix. Dicha supresividad está asociada a la microbiota presente en el suelo enmendado, ya que la capacidad supresiva se reduce al someter al suelo enmendado a un tratamiento térmico, y se produce su recuperación al complementar el suelo tratado con una porción de suelo natural de campo enmendado. Además, el uso de técnicas moleculares nos ha permitido conocer la composición y funcionalidad de la microbiota de los suelos supresivos. La secuenciación del ADN ribosómico del 16S (bacterias) y de las regiones ITS (hongos), reveló el predominio en la comunidad microbiana de representantes de los phyla Proteobacteria y Acidobacteria (que suponen más del 50% de las cepas bacterianas identificadas) y del phylum Ascomicota (40% de representantes fúngicos). Por otro lado, el uso de microarrays comerciales (GeoChip), nos ha permitido conocer el potencial génico de este suelo. Nuestros resultados revelan que en los suelos enmendados con cascara de almendra compostada, se aprecia un aumento significativo de la abundancia relativa de genes implicados en la degradación de distintas fuentes de carbono, así como una reducción de los genes relacionados con la virulencia, resistencia a metales y a otros componentes orgánicos tales como pesticidas, herbicidas o compuestos aromáticos. Estos resultados nos están permitiendo seleccionar y aislar grupos de microorganismos cultivables específicos y profundizar en los posibles mecanismos implicados en la supresividad.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Este trabajo está siendo financiado por el Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Economía (MINECO, España) (AGL2011-30354-C02-01) y cofinanciado por los fondos FEDER (EU). C. Vida está siendo financiada con una ayuda del programa FPI del MINECO

Aproximación funcional al efecto supresivo de la cáscara de almendra compostada aplicada al cultivo del aguacate

La podredumbre blanca de la raíz, causada por el hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix, es uno de los problemas más graves del cultivo del aguacate en el área mediterránea. Desde hace años, el manejo integrado de la enfermedad ha incluido la aplicación de enmiendas orgánicas como estrategia para mejorar el estado fitosanitario de los suelos agrícolas. En este trabajo, se llevaron a cabo ensayos “in vitro” frente a R. necatrix para evaluar la capacidad supresiva de los suelos enmendados con cáscara de almendra compostada, así como la implicación de la microbiota del suelo en la misma. Los resultados muestran que la adición de cáscara de almendra compostada al suelo, causa un aumento de la supresividad frente a R. necatrix asociada a la microbiota. El uso de técnicas de genómica molecular nos ha permitido conocer la composición y el potencial funcional de la microbiota de estos suelos. Estos análisis revelaron el predominio en la comunidad microbiana de representantes de los phyla Proteobacteria y Acidobacteria (que suponen más del 50% de las cepas bacterianas identificadas) y del phylum Ascomicota (40% de representantes fúngicos). Por otro lado, el uso de un microarray comercial (GeoChip), mostró la activación del ciclo del carbono a diferentes niveles y su implicación en la selección de grupos concretos de microorganismos, como los representantes de la clase Gammaproteobacteria. Finalmente, hemos realizado el aislamiento y caracterización de microorganismos cultivables con el fin de determinar su participación en el biocontrol de la enfermedad, lo que nos permitirá profundizar en el conocimiento de los posibles mecanismos implicados en la supresividad mediante técnicas de transcriptómica y proteómica.Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Microbial Profiling of a Suppressiveness-Induced Agricultural Soil Amended with Composted Almond Shells

This article is part of the Research Topic: Harnessing useful rhizosphere microorganisms for pathogen and pest biocontrol.-- Edited by: Aurelio Ciancio, Corné M. J. Pieterse and Jesús Mercado-Blanco.This study focused on the microbial profile present in an agricultural soil that becomes suppressive after the application of composted almond shells (AS) as organic amendments. For this purpose, we analyzed the functions and composition of the complex communities present in an experimental orchard of 40-year-old avocado trees, many of them historically amended with composted almond shells. The role of microbes in the suppression of Rosellinia necatrix, the causative agent of avocado white root rot, was determined after heat-treatment and complementation experiments with different types of soil. Bacterial and fungal profiles obtained from natural soil samples based on the 16S rRNA gene and ITS sequencing revealed slight differences among the amended (AS) and unamended (CT) soils. When the soil was under the influence of composted almond shells as organic amendments, an increase in Proteobacteria and Ascomycota groups was observed, as well as a reduction in Acidobacteria and Mortierellales. Complementary to these findings, functional analysis by GeoChip 4.6 confirmed these subtle differences, mainly present in the relative abundance of genes involved in the carbon cycle. Interestingly, a group of specific probes included in the “soil benefit” category was present only in AS-amended soils, corresponding to specific microorganisms previously described as potential biocontrol agents, such as Pseudomonas spp., Burkholderia spp., or Actinobacteria. Considering the results of both analyses, we determined that AS-amendments to the soil led to an increase in some orders of Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria, and Dothideomycetes, as well as a reduction in the abundance of Xylariales fungi (where R. necatrix is allocated). The combination of microbial action and substrate properties of suppressiveness are discussed.This work was supported by Plan Nacional I+D+I from Ministerio de Economia (MINECO) (AGL11-30354-C02-01 and AGL14-52518-C2-1-R), co-financed by FEDER funds (EU). CV was supported by a PhD fellowship from the FPI program of MINECO, and NB was supported by a PhD fellowship from the FPU program of MICINN.Peer reviewedPeer Reviewe