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Effect of hormones of the female reproductive tract on ram sperm functionality
La presencia de hormonas en el tracto reproductor femenino y su papel en la regulaci贸n de la reproducci贸n ha sido tema de estudio en m煤ltiples especies. Entre ellas se encuentran las hormonas esteroideas, como la progesterona y el estradiol, y otras como la melatonina. Las hormonas esteroideas, ejercen su mecanismo de acci贸n mediante la regulaci贸n de la expresi贸n g茅nica tras su uni贸n a receptores nucleares, tambi茅n llamados cl谩sicos. Sin embargo, estas hormonas tambi茅n pueden ejercer sus efectos de manera no gen贸mica en diferentes tipos celulares, provocando respuestas r谩pidas a trav茅s de receptores presentes en la membrana o en el citoplasma. En espermatozoides de diferentes especies se han descrito y localizado este tipo de receptores para progesterona y 17-尾 estradiol, as铆 como acciones no gen贸micas sobre procesos que tienen lugar en el tracto reproductor femenino como la capacitaci贸n, hiperactivaci贸n, quimiotaxis y la reacci贸n acros贸mica. Sin embargo, hasta el d铆a de hoy, no han sido descritos los receptores para estas hormonas en espermatozoides ovinos, por lo que este hito constituy贸 el primer objetivo de esta tesis. Nuestros estudios mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta e inmunocitoqu铆mica pusieron en evidencia, por primera vez, la localizaci贸n del receptor de progesterona (PR) en en la zona ecuatorial y la pieza intermedia del espermatozoide ovino. Los an谩lisis de western-blot de los extractos proteicos de los espermatozoides para el PR permitieron identificar un receptor con un peso molecular diferente al receptor cl谩sico descrito en humano, por lo que se tratar铆a de una isoforma del receptor cl谩sico o de un receptor de membrana espec铆fico para la especie ovina. As铆 mismo, tambi茅n se evidenci贸, por primera vez, la presencia de los receptores de estr贸genos, ER伪 y ER尾 en el espermatozoide ovino, localiz谩ndose en la zona post-acrosomal y en la regi贸n apical respectivamente, y correspondiendo su peso molecular a los de los receptores nucleares cl谩sicos. Adem谩s, nuestros resultados demostraron una correlaci贸n positiva entre la presencia del receptor ER尾 y el porcentaje de espermatozoides no capacitados evaluados por la tinci贸n con clorotetraciclina. El porcentaje de c茅lulas marcadas (ER尾+) disminuy贸 significativamente tras la capacitaci贸n in vitro, y pr谩cticamente desapareci贸 tras la inducci贸n de la reacci贸n acros贸mica con lisofosfatidilcolina (LPC). Sin embargo, la localizaci贸n de los receptores PR y ER伪 no cambi贸 durante la capacitaci贸n ni tras la reacci贸n acros贸mica (Art铆culo 1). Una vez demostrada la presencia de los receptores para progesterona y estr贸genos en el espermatozoide de morueco, nos planteamos, como segundo objetivo, determinar la implicaci贸n de ambas hormonas esteroideas, progesterona y 17-尾 estradiol, en la funcionalidad del espermatozoide ovino. Se llevaron a cabo experimentos con diferentes concentraciones de hormonas en un medio con y sin sustancias elevadoras del cAMP (cocktail) que promueven la capacitaci贸n in vitro en la especie ovina. Ambas hormonas provocaron un aumento del porcentaje de espermatozoides reaccionados (AR) tras 3 horas de incubaci贸n, pero 煤nicamente la progesterona a baja (100 pM) y media (10 nM) concentraci贸n en un medio cocktail provoc贸 un aumento en la fosforilaci贸n de prote铆nas en residuos de tirosina (TyrPP). Ambas hormonas a baja concentraci贸n tambi茅n provocaron una disminuci贸n de la motilidad total cuando se a帽adieron a los espermatozoides en un medio cocktail. Por lo tanto, nuestros resultados ponen de manifiesto por primera vez el papel de la progesterona y 17-尾 estradiol sobre la funcionalidad esperm谩tica ovina y la capacidad de inducir la reacci贸n acros贸mica en el espermatozoide ovino (Art铆culo 1). Una vez determinados los efectos de la progesterona y 17-尾 estradiol en la funcionalidad del espermatozoide ovino, nos planteamos estudiar, como tercer objetivo, si dichos efectos estaban mediados por su uni贸n a los receptores, PR, ER伪 y ER尾, que hab铆amos evidenciado. Para ello, incubamos espermatozoides ovinos en condiciones capacitantes, en presencia o ausencia de agonistas y antagonistas de PR y ER. La incubaci贸n con los agonistas provocaron un aumento del porcentaje de espermatozoides reaccionados (AR), en alg煤n caso superior al inducido por la hormona, mientras que los antagonistas inhibieron el efecto inductor de la progesterona y el 17-尾 estradiol sobre la reacci贸n acros贸mica. Adem谩s, la incubaci贸n con los agonistas, tanto de PR como de ER, provoc贸 un descenso de la motilidad progresiva mientras que la incubaci贸n con los antagonistas (previa a la adici贸n de las hormonas) provoc贸 un aumento significativo de este par谩metro. Estos resultados confirman que tanto la progesterona como el 17-尾 estradiol son capaces de inducir la reacci贸n acros贸mica en espermatozoides ovinos, y que esta acci贸n est谩 mediada por su uni贸n a sus receptores (Art铆culo 2). El cuarto objetivo de esta tesis fue profundizar en el conocimiento del mecanismo de acci贸n de la progesterona y el 17-尾 estradiol en el espermatozoide ovino, analizando los mecanismos moleculares subyacentes al proceso de capacitaci贸n y reacci贸n acros贸mica. Para ello, evaluamos la distribuci贸n de TyrPP tras la capacitaci贸n in vitro mediante IIF. Ambas hormonas provocaron cambios diferentes en la localizaci贸n de las TyrPP en los espermatozoides. La progesterona dio lugar a la desaparici贸n de TyrPP del acrosoma, provocando un descenso de la subpoblaci贸n con marcaje en acrosoma, zona ecuatorial y flagelo, que correlacionaba con espermatozoides capacitados, y un aumento de la subpoblaci贸n con marcaje en la zona ecuatorial y flagelo, correlacionada con los espermatozoides reaccionados, mientras que este efecto no se observ贸 en los espermatozoides incubados con estradiol. Adem谩s, la progesterona provoc贸 un aumento en los niveles de calcio intracelular y una movilizaci贸n de este ion hacia el acrosoma, as铆 como un aumento en los niveles de especies ox铆geno reactivas (ROS) y una rotura significativa del acrosoma (evidenciada mediante el uso de lectinas). Sin embargo, el 17-尾 estradiol no dio lugar a ninguno de estos cambios. La v铆a cAMP-PKA no parece estar involucrada en los efectos de ninguna de estas hormonas esteroideas en el espermatozoide ovino. Finalmente, ni la progesterona ni el estradiol provocaron un aumento en los par谩metros cin茅ticos relacionados con la hiperactivaci贸n esperm谩tica (Art铆culo 3). As铆, nuestros resultados demostraron que, aunque la progesterona y el 17-尾 estradiol promueven mecanismos conducentes a la inducci贸n de la reacci贸n acros贸mica en los espermatozoides ovinos, estos mecanismos son diferentes. Por 煤ltimo, quisimos profundizar en el efecto de otra hormona presente en el tracto reproductor femenino, la melatonina, sobre la funcionalidad esperm谩tica ovina. Esta hormona es secretada por la hip贸fisis y controla la estacionalidad reproductiva a trav茅s tambi茅n del eje hipot谩lamo-hipofisario-gonadal, pero tambi茅n se secreta en otros tejidos y es capaz de ejercer efectos directos sobre las c茅lulas, incluyendo los espermatozoides. En estudios previos, nuestro grupo identific贸 los receptores de melatonina, MT1 Y MT2 , en la membrana plasm谩tica del espermatozoide ovino y demostr贸 que, entre otras acciones, esta hormona provocaba efectos opuestos en funci贸n de su concentraci贸n, sobre la capacitaci贸n esperm谩tica ovina. Por ello, el 煤ltimo objetivo de esta tesis se centr贸 en investigar los mecanismos moleculares por los que la melatonina ejerce su acci贸n dual capacitante/descapacitante sobre el espermatozoide ovino. Se comprob贸 que la melatonina a alta concentraci贸n (1 渭M) daba lugar a la inhibici贸n del proceso de capacitaci贸n y de reacci贸n acros贸mica mediante la disminuci贸n de los niveles de fosfotirosinas y de ROS. Por otro lado, tras un estudio de an谩lisis de componentes principales (PCA), se pudo comprobar que la melatonina a concentraciones bajas (100 pM y 10 nM) promueve la hiperactivaci贸n. Sin embargo, no se pudo confirmar el papel de la v铆a cAMP-PKA en estos procesos, ya que aunque la melatonina a concentraci贸n alta fue capaz de modificar los niveles de cAMP, no provoc贸 cambios en la actividad de la enzima PKA durante la capacitaci贸n esperm谩tica ovina (Art铆culo 4 + Anexo I). En conclusi贸n, los resultados de esta tesis doctoral demuestran el papel de las hormonas esteroideas, progesterona y 17-尾 estradiol, en la inducci贸n de la reacci贸n acros贸mica, y el papel dual capacitante/descapacitante de la melatonina en el espermatozoide ovino, lo que abre nuevas posibilidades para el uso de las mismas, o bien agonistas o antagonistas de sus receptores, para la formulaci贸n de diluyentes o medios empleados en inseminaci贸n artificial o para el mantenimiento de las dosis seminales. As铆 mismo, tambi茅n abre nuevas perspectivas en la investigaci贸n del mecanismo de acci贸n de estas hormonas a trav茅s otras v铆as distintas a la v铆a cAMP-PKA y que podr铆an estar implicadas en la funcionalidad del espermatozoide ovino. <br /
Estudio de las v铆as de degradaci贸n enzim谩tica de la melatonina en el tracto reproductor masculino de la especie ovina
La melatonina es una de las mol茅culas m谩s antiguas y biol贸gicamente activas. Se encuentra en una amplia variedad de organismos, siendo su principal funci贸n la defensa antioxidante. La melatonina es sintetizada en la gl谩ndula pineal durante la noche, y es degradada por diversos 贸rganos como el h铆gado, cerebro o retina. Estudios previos han determinado la presencia de las enzimas de s铆ntesis de melatonina en el test铆culo ovino (serotonin-N-acetiltransferasa (AANAT) y N-acetilserotonin-O-metiltransferasa (ASMT)) y altas concentraciones de melatonina en el plasma seminal ovino. Sin embargo, las posibles v铆as de degradaci贸n de esta hormona en el tracto reproductor del macho no han sido estudiadas previamente. Con el fin de determinar si la melatonina es degradada en el aparato reproductor del morueco, se realizaron diversos estudios de las principales v铆as de degradaci贸n enzim谩tica de la hormona en los tejidos del tracto genital (test铆culo, epid铆dimo y gl谩ndulas accesorias) mediante RT-PCR, q-PCR y Western-Blot. Las enzimas que se estudiaron fueron: Mieloperoxidasa (MPO), Indoleamina-2,3-dioxigenasa 1 (IDO1) y 2 (IDO2). Se demostr贸 la expresi贸n g茅nica mediante RT-PCR de las tres enzimas en todos los tejidos estudiados, mientras que la q-PCR permiti贸 comprobar que la expresi贸n g茅nica de la enzima MPO es predominante sobre IDO1 e IDO2 en casi todos los tejidos, siendo el test铆culo y gl谩ndulas bulbouretrales los tejidos que presentan los mayores niveles de expresi贸n. Mediante Western-Blot, se demostr贸 la traducci贸n de la prote铆na MPO en las gl谩ndulas bulbouretrales, aunque en el caso de IDO, los resultados obtenidos no fueron concluyentes. En conclusi贸n, nuestros resultados indican la existencia de una ruta de degradaci贸n enzim谩tica de la melatonina en el tracto genital. Dado que los metabolitos producidos en la degradaci贸n de esta hormona son compuestos antioxidantes, su producci贸n en el aparato reproductor podr铆a tener una implicaci贸n directa en la defensa de los espermatozoides ante las especies reactivas de ox铆geno
Efecto del fluido folicular en la quimiotaxis esperm谩tica ovina en funci贸n del momento del ciclo estral.
El fluido folicular conforma el entorno bioqu铆mico en el que se desarrolla el ovocito previo a su ovulaci贸n. Contiene hormonas, iones, metabolitos y factores de crecimiento entre otros muchos compuestos, cuya concentraci贸n var铆a a lo largo del ciclo reproductivo estral. Alguno de estos compuestos podr铆a estar involucrado en la respuesta quimiot谩ctica de los espermatozoides, mediante la cual ser铆an guiados hacia el ovocito para que se produzca la fecundaci贸n. Otro requisito fundamental para la fecundaci贸n es la capacitaci贸n, conjunto de cambios moleculares y bioqu铆micos que sufre el espermatozoide y le confieren capacidad fecundante.En estudios realizados en rat贸n y humano, se ha descrito que el fluido folicular ejerce una acci贸n quimioatrayente para los espermatozoides, pero hasta el momento no existe ning煤n estudio en la especie ovina. Por ello, el objetivo central de este trabajo consisti贸 en estudiar la capacidad quimiot谩ctica del fluido folicular de la oveja sobre los espermatozoides ovinos. Teniendo en cuenta la composici贸n variable de dicho fluido a lo largo del ciclo estral, se ensayaron fluidos foliculares obtenidos de dos momentos distintos del ciclo: en fase folicular temprana (proestro) y luteal temprana (metaestro), ambos a concentraciones de 2% y 10% (v/v). Dado que algunos estudios apuntan a que s贸lo los espermatozoides capacitados son capaces de responder ante un agente quimiot谩ctico, en este estudio se usaron tanto espermatozoides sin capacitar, como capacitados in vitro en presencia o ausencia de agentes elevadores de AMPc (cocktail y control, respectivamente). Tras la valoraci贸n previa del estado de los espermatozoides (motilidad, viabilidad y estado de capacitaci贸n), se realizaron los ensayos de quimiotaxis utilizando c谩maras IBIDI庐 碌-Slide Chemotaxis, y se analizaron mediante el software de acceso libre OpenCASA, que proporciona un valor de 铆ndice quimiot谩ctico.Los resultados obtenidos demuestran que el fluido folicular, tanto obtenido en fase folicular como luteal temprana, ejerce una acci贸n quimiot谩ctica a ambas concentraciones ensayadas, atrayendo hacia s铆, de una manera significativa, 煤nicamente a los espermatozoides capacitados in vitro. Se puede afirmar por ello, que el fluido folicular act煤a como quimioatrayente esperm谩tico en la especie ovina.Follicular fluid is the biochemical environment in which oocytes develop before ovulation. It contains hormones, ions, metabolites, growth factors and some other compounds which concentration vary along the oestral reproductive cycle. Some of these compounds may be involved in spermatic chemotactic response, which guides spermatozoa towards the oocyte for producing fertilization. Other main requierement for fertilization is capacitation, in which spermatozoa suffer molecular and biochemical changes necessary for acquire fertilizing ability.Follicular fluid has a chemotactic effect on mouse and human spermatozoa, but, so far, this effect has not been demonstrated in ram sperm. Thus, the main objective of this work was to evaluate the follicular fluid chemotactic effect on ram spermatozoa.The composition of follicular fluid varies along the reproductive cycle. Thus, we evaluated ewe follicular fluid obtained from two different stages of oestruscycle, early follicular phase (proestrus) and early luteal phase (metaestrus), both at 2% and 10% (v/v) concentrations. Previous studies had concluded that only capacitated spermatozoa show response towards chemotactic compounds, so in this study were used not only swim-up selected spermatozoa (non-capacitated), but also capacitated spermatozoa in vitro in the presence or absence of cAMP rising factors (named cocktail and control, respectively). After sperm evaluation (motility, viability and capacitation), chemotactic assays were performed in IBIDI庐 碌-Slide Chemotaxis chambers, and the results were analyzed by the OpenCASA software, that can calculate the chemotactic index.Our results demonstrate that both follicular fluids, obtained in early follicular phase and early luteal phase, produce a chemotactic response at both concentrations tested, only on in vitro capacitated spermatozoa. In conclusion, follicular fluid is a spermatic chemoattractant in sheep.<br /
Influencia de los polimorfismos de MTNR1A en el efecto crioprotector de la melatonina en dosis seminales ovinas
La refrigeraci贸n y la congelaci贸n del semen provoca una serie de efectos perjudiciales para los espermatozoides conocidos como cold-shock, que podr铆an ser evitados parcialmente empleando agentes crioprotectores, entre ellos, la melatonina. Esta hormona puede llevar a cabo alguno de sus efectos uni茅ndose a sus receptores de membrana, MT1 y MT2. El gen del receptor de melatonina 1A (MNTR1A) presenta varios polimorfismos, pero se desconoce si podr铆an influir en el efecto de la melatonina durante la criopreservaci贸n de dosis seminales ovinas.As铆, el objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia de los polimorfismos de MTNR1A en el efecto crioprotector de la melatonina en espermatozoides ovinos. Para ello, muestras seminales de seis moruecos adultos, previamente genotipados para el polimorfismo RsaI del gen MTNR1A (2 C/C, 2 C/T y 2 T/T), se refrigeraron y congelaron sin y con melatonina 1 mM y 1 渭M. Antes y despu茅s de este proceso se evalu贸 la motilidad, integridad de membrana, estado de capacitaci贸n y marcadores apopt贸ticos de los espermatozoides.<br /
Efecto de la melatonina sobre la capacitaci贸n esperm谩tica en la especie ovina
La melatonina es una hormona importante en la regulaci贸n de la reproducci贸n, por lo que el descubrimiento de la presencia de los receptores de esta hormona en la superficie del espermatozoide ovino permite especular sobre su importancia en la funcionalidad esperm谩tica. Se sabe que, en ciertas c茅lulas som谩ticas, ejerce sus acciones a trav茅s de diversas v铆as moleculares, algunas implicadas en la regulaci贸n de procesos fisiol贸gicos del espermatozoide, como la capacitaci贸n. Esta capacitaci贸n es el conjunto de cambios moleculares y fisiol贸gicos que sufre el espermatozoide y que le confieren capacidad fecundante. Por otro lado, es sabido que la melatonina tiene la capacidad de reducir el estr茅s oxidativo inducido por especies reactivas de ox铆geno (ROS) y que durante la capacitaci贸n in vitro se produce un incremento de los niveles de ROS. Bas谩ndonos en estos datos, en el presente trabajo se plante贸 la hip贸tesis de que la melatonina jugar铆a un papel crucial en la capacitaci贸n esperm谩tica. El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de diferentes concentraciones de melatonina sobre distintos par谩metros relacionados con la funcionalidad esperm谩tica en muestras sometidas a capacitaci贸n in vitro. Los par谩metros analizados fueron la motilidad y la viabilidad celular y otros especialmente vinculados con la capacitaci贸n, como la hiperactivaci贸n, la distribuci贸n y la cantidad de calcio intracelular, los niveles de ROS, la cantidad de AMPc y los niveles de fosforilaci贸n en residuos de tirosina de las prote铆nas esperm谩ticas. Los resultados obtenidos en este trabajo indicaron que ninguna de las concentraciones de melatonina utilizadas (100 pM, 10 nM y 1 渭M) modificaron significativamente el porcentaje de espermatozoides m贸tiles o con membrana plasm谩tica 铆ntegra con respecto a las muestras capacitadas sin melatonina. Sin embargo, la presencia de 1 渭M de melatonina en el medio de capacitaci贸n dio lugar a un menor porcentaje de espermatozoides capacitados (p<0,001) junto con menores niveles de ROS y calcio intracelular y adem谩s menor grado de fosforilaci贸n en residuos de tirosinas. En conclusi贸n, en este estudio se demostr贸 que la melatonina tiene efectos directos sobre la capacitaci贸n del espermatozoide ovino
Efecto de la melatonina sobre la Ca2+/Calmodulina prote铆n-kinasa II de los espermatozoides ovinos
La melatonina es una hormona que se sintetiza principalmente en la gl谩ndula pineal y que regula muchos procesos fisiol贸gicos, como la reproducci贸n estacional. A nivel celular es capaz de aumentar los niveles de calcio intracelular en c茅lulas som谩ticas y unirse a la prote铆na calmodulina. Esto inhibe la formaci贸n del complejo calcio/calmodulina, que regula la actividad de la enzima calcio/calmodulina prote铆n-quinasa II (CaMKII). Dado que tanto el aumento de los niveles de calcio como la actividad de CaMKII est谩n implicados en la capacitaci贸n esperm谩tica (conjunto de cambios que debe sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), en el presente trabajo se plante贸 la hip贸tesis de que la melatonina podr铆a modular la capacitaci贸n esperm谩tica ovina a trav茅s de la enzima CaMKII. As铆, los objetivos de este estudio fueron investigar el efecto de la melatonina sobre los niveles y distribuci贸n del calcio intracelular, identificar la presencia de la prote铆na CaMKII en el espermatozoide ovino y evaluar los cambios en la concentraci贸n de la misma en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 掳C y 5% de CO2) en medio TALP (control), y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 碌M). Tras la incubaci贸n se evalu贸 la motilidad, viabilidad, y estado de capacitaci贸n de las muestras. Los cambios en la concentraci贸n y distribuci贸n de calcio intracelular se evaluaron mediante citometr铆a de flujo con las sondas Fluo-4 AM y Rhod-5N AM. Finalmente, la identificaci贸n y cuantificaci贸n de CaMKII se realiz贸 mediante Western Blot en prote铆nas esperm谩ticas extra铆das tras la capacitaci贸n in vitro. Los resultados obtenidos indican que la melatonina a una concentraci贸n 1 碌M es capaz de aumentar el porcentaje de espermatozoides vivos con altos niveles de calcio tras tres horas de incubaci贸n en condiciones capacitantes, sin afectar negativamente a la funcionalidad esperm谩tica. Adem谩s, la presencia de melatonina en el medio parece aumentar los niveles de CaMKII y de una de sus isoformas (CaMKII伪) en el espermatozoide de morueco. En conclusi贸n, este trabajo sugiere que la melatonina podr铆a regular el proceso de capacitaci贸n esperm谩tica aumentando los niveles de la enzima CaMKII, aunque las implicaciones que puede tener esto en su activaci贸n o actividad todav铆a no est谩n esclarecidas
Relaci贸n de la melatonina con el metabolismo del 贸xido n铆trico en espermatozoides ovinos
En la especie ovina la reproducci贸n tiene un car谩cter estacional muy marcado regulado por la secreci贸n de melatonina. Esta mol茅cula tiene, adem谩s, una gran capacidad antioxidante y es capaz de reducir, entre otras especies reactivas, los niveles de 贸xido n铆trico (NO). El NO se genera v铆a oxidaci贸n de L-arginina por la actividad de la 贸xido n铆trico sintasa o sintetasa (NOS). Existen tres isoformas de esta enzima: la neuronal (nNOS), la endotelial (eNOS) y la inducible (iNOS). En espermatozoides humanos se han identificado las tres isoformas de NOS y se ha demostrado que su actividad se incrementa a lo largo del proceso de capacitaci贸n in vitro. En espermatozoides ovinos, cuya capacitaci贸n in vitro resulta mucho m谩s complicada que en otras especies, no existen estudios que hayan identificado alguna de las isoformas de NOS. Por tanto, el objetivo de este Trabajo de Fin de Master es estudiar la acci贸n de la melatonina a diferentes concentraciones fisiol贸gicas, sobre los niveles de NO en espermatozoides ovinos incubados en condiciones capacitantes, identificar si las tres isoformas descritas de NOS est谩n presentes en espermatozoides ovinos y evaluar el efecto de la melatonina sobre estas isoformas de NOS. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 掳C y 5% de C02) en medio TALP (control), con alto cAMP (cocktail) y con dos concentraciones de melatonina (100 pM y 1 碌M) a帽adidas al medio cocktail, y se evaluaron los niveles de NO mediante citometr铆a de flujo. Para determinar si este efecto estaba mediado por la acci贸n de la 贸xido n铆trico sintasa, previamente se identificaron en espermatozoides ovinos las tres isoformas de la enzima descritas para otras especies, tras poner a punto los protocolos de western blot y de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Finalmente se evaluaron los cambios en la distribuci贸n de estas isoformas de NOS mediante IFI tras incubaci贸n de los espermatozoides en presencia de melatonina. Los resultados obtenidos indican que la melatonina, a concentraci贸n 1 碌M, es capaz de reducir significativamente los niveles de NO, los cuales se ven incrementados durante la capacitaci贸n esperm谩tica. Adem谩s se han identificado, por primera vez en el espermatozoide ovino, las tres isoformas de NOS, mediante western blot e inmunofluorescencia indirecta. La IFI tambi茅n revel贸 tres inmunotipos esperm谩ticos para cada una de las isoformas de NOS, cuyos porcentajes se modificaron durante la capacitaci贸n y el tratamiento con melatonina. As铆, la localizaci贸n en el borde apical de las isoformas eNOS e iNOS disminuye con la capacitaci贸n y la melatonina, a concentraci贸n 1 碌M y 100 pM, modifica el efecto producido por los agentes capacitantes sobre el porcentaje de los inmunotipos de la nNOS e iNOS, revirti茅ndolo en la primera y aument谩ndolo en la segunda. Por tanto, la melatonina durante la capacitaci贸n de los espermatozoides ovinos parece ejercer un papel antioxidante reduciendo los niveles de NO, posiblemente generado por las isoformas identificadas de la NOS. Adem谩s, el tratamiento con melatonina parece modificar la localizaci贸n de alguna de las isoformas de la NOS en el espermatozoide ovino
Implicaci贸n de la NOX5 en la acci贸n antioxidante y sobre la capacitaci贸n de la melatonina en los espermatozoides
Las especies reactivas de ox铆geno (ROS) juegan un papel muy importante en el proceso de capacitaci贸n de los espermatozoides de mam铆fero. Una de las enzimas involucradas en la producci贸n de ROS en el espermatozoide es la NADPH oxidasa 5 (NOX5). Por otro lado, la melatonina es una hormona capaz de disminuir los niveles de ROS en las c茅lulas, y regular la actividad de NOX en c茅lulas som谩ticas. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue identificar la NOX5 en el espermatozoide ovino y analizar la acci贸n de la melatonina sobre esta enzima.Para ello, se seleccionaron espermatozoides libres de plasma seminal mediante el m茅todo Swim-up y NOX5 se identific贸 mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) y Western Blot tras poner a punto los protocolos.Posteriormente, los espermatozoides seleccionados por Swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 掳C y 5% de CO2) en un medio TALP o un medio TALP con sustancias potenciadoras de la capacitaci贸n (Cocktail), con y sin melatonina 1 碌M. Tras la incubaci贸n se evalu贸 motilidad, viabilidad, estado de capacitaci贸n y especies reactivas de ox铆geno. Adem谩s, para determinar un posible efecto de la melatonina sobre NOX5, se evalu贸 la distribuci贸n de NOX5 mediante IFI y se cuantific贸 por densitometr铆a tras Western Blot.Los resultados demostraron la presencia de NOX5 en el espermatozoide ovino, con la identificaci贸n mediante Western Blot de una banda de 85 kDa, compatible con el peso molecular de esta enzima. Adem谩s, la IFI rebel贸 la presencia de 6 inmunotipos distintos en estas c茅lulas, con marcaje en la pieza intermedia, acrosoma, zona apical, zona apical y postacrosomal, acrosoma y postacrosoma o s贸lo postacrosoma. Asimismo, la capacitaci贸n en medio TALP y Cocktail produjo una variaci贸n en el porcentaje de los distintos inmunotipos para NOX5 con respecto a la muestra Swim-up, mientras que la incubaci贸n con melatonina revirti贸 el porcentaje de los distintos inmunotipos a niveles similares a los de la muestra inicial. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en el an谩lisis densitom茅trico tras la capacitaci贸n, y la melatonina s贸lo disminuy贸 el porcentaje de c茅lulas con bajos niveles de ROS en el medio TALP.En conclusi贸n, NOX5 est谩 presente en el espermatozoide ovino, y la melatonina en condiciones capacitantes afecta a la distribuci贸n pero no a la concentraci贸n de esta enzima. <br /
Estudio de las rutas moleculares implicadas en la acci贸n de la melatonina sobre la calcio-calmodulina kinasa II de los espermatozoides
La melatonina es una hormona sintetizada principalmente en la gl谩ndula pineal que est谩 implicada en la regulaci贸n de muchos procesos biol贸gicos, entre los que se encuentra la reproducci贸n estacional en algunos mam铆feros. A nivel celular, la melatonina puede llevar a cabo sus efectos regulatorios a trav茅s de dos v铆as: bien por la uni贸n a receptores espec铆ficos de membrana, denominados MT1 y MT2, o bien atravesando directamente la membrana plasm谩tica. En el espermatozoide ovino se ha descrito que la melatonina modula la capacitaci贸n esperm谩tica (conjunto de cambios bioqu铆micos y biof铆sicos que necesita sufrir un espermatozoide para adquirir capacidad fecundante), de forma que a帽adida a concentraciones altas (1 M) tiene un efecto descapacitante. Dado que la enzima calcio-calmodulina prote铆n-kinasa II (CaMKII) tambi茅n est谩 implicada en la capacitaci贸n esperm谩tica, el objetivo principal de este trabajo fue evaluar el efecto de la melatonina, y de un agonista y un antagonista de los receptores de la misma, sobre la capacitaci贸n esperm谩tica y sobre los niveles y la activaci贸n por modificaciones postraduccionales de la CaMKII en espermatozoides ovinos. Para ello, espermatozoides ovinos seleccionados por swim-up se incubaron durante 3 horas en condiciones capacitantes (39 C, 5 % de CO2 y 100 % humedad) en medio TALP (control), en un medio con agentes elevadores del AMPc (cocktail), en medio cocktail con melatonina a una concentraci贸n 1 M, y con un agonista (8M-PDOT) o un antagonista (4P-PDOT) de los receptores de melatonina a帽adidos a diferentes concentraciones (1 M y 10 nM). Tras la incubaci贸n se evalu贸 la motilidad, viabilidad y estado de capacitaci贸n mediante tinci贸n con clorotetraciclina y fosforilaci贸n en residuos de tirosina evaluados por western-blot. El an谩lisis de los cambios en los niveles de CaMKII y su isoforma CaMKII伪 se realizaron mediante un inmunoensayo ELISA y la identificaci贸n y cuantificaci贸n de las modificaciones post-traduccionales en CaMKII se realiz贸 mediante western-blot. Los resultados obtenidos mostraron que la incubaci贸n con melatonina o su agonista a una concentraci贸n 1 M aument贸 el porcentaje de espermatozoides no capacitados (PEn conclusi贸n, este trabajo sugiere que la melatonina ejercer铆a su acci贸n descapacitante a trav茅s de la uni贸n a sus receptores de membrana, pero no modificar铆a los niveles o la activaci贸n de la enzima CaMKII por medio de modificaciones post-traduccionales, al menos mediante fosforilaci贸n.<br /
Efecto de la subnutrici贸n materna periconcepcional sobre los resultados reproductivos de ovejas y la calidad oocitaria de sus corderas
Los objetivos de 茅ste trabajo han sido estudiar el efecto de una subnutrici贸n severa en los d铆as previos y posteriores a la concepci贸n sobre los par谩metros reproductivos de las ovejas y conocer el posible efecto de esta subnutrici贸n sobre la calidad ovocitaria de las corderas nacidas de dicha concepci贸n. Para ello se realizaron dos experiencias en el Servicio de Experimentaci贸n Animal de la Universidad de Zaragoza, con procedimientos aprobados por la Comisi贸n 脡tica Asesora para la Experimentaci贸n Animal. Ochenta (experimento 1) y cuarenta (experimento 2) ovejas de raza Rasa Aragonesa se sincronizaron en celo mediante esponjas vaginales y la administraci贸n de 300 UI de eCG durante 14 d铆as y fueron cubiertas a partir de las 36 horas de la retirada de las esponjas (celo=d铆a 0). Desde el momento de la colocaci贸n de las esponjas y hasta el d铆a 7 (experimento 1) 贸 15 (experimento 2) despu茅s de los celos, las ovejas fueron alimentadas en grupo para cubrir 1,5 (grupo Control, C) o 0,5 (grupo Bajo, B) veces sus necesidades de mantenimiento (M). A partir del d铆a 7 (experimento 1) 贸 del d铆a 15 (experimento 2) las ovejas se reagruparon y fueron sometidas a la dieta 1,5 M hasta el los partos. En esto momento se registr贸 el peso vivo al nacimiento de los corderos y se pesaron semanalmente hasta el momento del destete, con 40 d铆as de edad. Seis corderas en cada experimento, hijas de ovejas pertenecientes a los dos grupos nutricionales (3 por grupo) fueron sacrificadas a los dos meses de vida, se extrajeron sus ovarios y se recuperaron sus ovocitos, en cada uno de los experimentos. Estos ovocitos, una vez clasificados, se seleccionaron los aptos y se maduraron y fecundaron. De cada animal se registr贸 el n煤mero de ovocitos recuperados tanto aptos como no aptos para la maduraci贸n. Las tasas de maduraci贸n y divisi贸n se calcularon en funci贸n del n煤mero de ovocitos aptos y la tasa de fertilizaci贸n se bas贸 en el n煤mero de ovocitos madurados. Las ovejas del lote control mantuvieron su peso vivo (PV) y condici贸n corporal (CC) a lo largo de la experiencia, mientras que las subnutridas experimentaron una p茅rdida significativa (p<0,05) tanto del PV como CC. La subnutrici贸n periconcepcional dio lugar a unos resultados reproductivos inferiores al lote control, con diferencias significativas para la prolificidad y fecundidad en el experimento 1 (p<0,05) y con una tendencia a la significaci贸n (p=0,10) para la fertilidad y fecundidad en el experimento 2. La duraci贸n de la media de la gestaci贸n fue similar en ambos lotes, as铆 como la tasa machos/hembras nacidos. El PV medio de los corderos nacidos de las ovejas del lote B fue significativamente (p<0,05) superior que los corderos del lote C, roz谩ndose la significaci贸n al comparar los corderos del mismo sexo. Por el contrario, no hubo diferencias en el PV al destete ni en el crecimiento medio diario hasta ese momento. Respecto a la poblaci贸n oocitaria, las corderas hijas del lote B presentaron un mayor n煤mero de ovocitos a los dos meses de vida. En conclusi贸n, un nivel de subnutrici贸n del 50% alrededor de la concepci贸n se refleja negativamente sobre el rendimiento reproductivo, vi茅ndose afectados par谩metros como la prolificidad, fertilidad y fecundidad. Los corderos nacidos de madres pertenecientes al lote B presentan un PV medio superior. Las corderas nacidas de madres subnutridas presentan una alteraci贸n en la cantidad de ovocitos recuperados, siendo superior a las corderas nacidas de ovejas del lote C