Les synaptotagmines et le transport vésiculaire dans les cellules ? pancréatiques : une isoforme pour chaque étape ?

La libération de l'insuline dans le milieu extracellulaire nécessite la fusion d'une vésicule large à coeur dense (VLCD) avec la membrane plasmique. Ce phénomène, appelé exocytose, est déclenché par une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium. Le senseur calcique des cellules β pancréatiques n'est pas strictement connu, cependant une famille de protéines, les Synaptotagmines (Syt) est impliquée dans cette fonction dans les neurones. Afin de caractériser cette famille de protéines dans les cellules insulino-sécrétoires, nous avons produit des anticorps mono-spécifiques des isoformes Syt 8 à Syt 11 et Syt 13. Grâce à ces anticorps et par des techniques de fractionnement cellulaire et d'immunofluorescence nous avons pu établir (1) que l'isoforme Syt 8 a un comportement biochimique de protéine cytosolique (2) que Syt 10 est exprimée dans les cellules primaires du pancréas endocrine, dans les neurones d'hippocampe et dans les cellules chromaffines, mais pas dans les lignées clonales insulino-sécrétoires (3) que Syt 11 et Syt 13 sont exprimées dans les cellules insulino-sécrétoires (4) que Syt 11 est localisée, dans les cellules β pancréatiques, dans un compartiment précoce de la voie de sécrétion qui pourrait être le compartiment intermédiaire (5) Syt 9, mais pas Syt 7, est localisée sur les VLCD et pourrait donc jouer le rôle de senseur calcique de la sécrétion d'insuline. En conclusion, ce travail a permis de caractériser plus précisément la distribution des isoformes des Syt dans les cellules insulino-sécrétoires. Grâce aux anticorps spécifiques et au travail de localisation nous avons ouvert la voie des études fonctionnelles de cette famille de protéines qui semble impliquée dans toutes les étapes du transport vésiculaire.Insulin is released into the extracellular space by fusion of Large Dense Core Vesicles (LDCV) with the plasma membrane. This process, called exocytosis, is triggered by a rise in intracellular calcium. In pancreatic β cells, the principal calcium sensor is currently not precisely known. In neurons a family of proteins, the Synaptotagmins (Syt), play a central role in triggering exocytosis. 16 Syt are known and the elucidation of their subcellular localisation is a prerequisite for functional studies. To further characterise this family in pancreatic β cells, we have used commercial antibodies as well as produced and thoroughly characterized specific antibodies against Syt 8 to Syt 11 and Syt 13. Using subcellular fractionation and immunofluorescence we have established that (1) Syt 8 is expressed as a soluble protein in endocrine cells, (2) Syt 10 is expressed in primary endocrine pancreatic β cells, hippocampal neurons and chromaffin cells but not in clonal insulin-secreting cells, (3) Syt 11 and Syt 13 are expressed in insulin-secreting cells, (4) in pancreatic β cells Syt 11 is localised in an early compartment of the secretory pathway, which could be the intermediate compartment, (5) Syt 9, but not Syt 7, is present on LDCV and may therefore play a major role in triggering exocytosis of insulin-containing vesicles. In conclusion, using specific polyclonal antibodies, we have characterised the distribution of synaptotagmin isoforms in insulin-secreting cells. The observed distribution suggest that this family of protein may be implicated in several steps of intracellular vesicular transport. Functional studies are now to be undertaken in order to precisely describe the role of each isoform

Les synaptotagmines et le transport vésiculaire dans les cellules b pancréatiques (une isoforme pour chaque étape ?)

La libération de l'insuline dans le milieu extracellulaire nécessite la fusion d'une vésicule large à cœur dense (VLCD) avec la membrane plasmique. Ce phénomène, appelé exocytose, est déclenché par une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium. Le senseur calcique des cellules b pancréatiques n'est pas strictement connu, cependant une famille de protéines, les Synaptotagmines (Syt) est impliquée dans cette fonction dans d'autres types cellulaires. Afin de caractériser cette famille de protéines dans les cellules insulino-sécrétoires, nous avons produit des anticorps des isoformes des Syt (Syt8 à Syt 11 et Syt 13). Grâce à ces anticorps et par des techniques de fractionnement cellulaire et d'immunofluorescence nous avons pu établir (1) que l'isoforme Syt 8 a un comportement biochimique de protéine cytosolique (2) que Syt 10 est exprimée dans les cellules primaires du pancréas endocrine, dans les neurones d'hippocampe et dans les cellules chromaffines (3) que Syt 11 et Syt 13 sont exprimées dans les cellules insulino-sécrétoires (4) que Syt11 est localisée, dans les cellules b pancréatiques, dans un compartiment précoce de la voie de sécrétion qui pourrait être le compartiment intermédiaire. De plus Syt 7, dans les cellules insulino-sécrétoires, n'est pas localisée sur les VLCD ou la membrane plasmique et ne joue donc pas le rôle de senseur calcique de l'exocytose de l'insuline. En revanche, Syt9 est localisée sur les VLCD dans ces cellules et pourrait donc jouer le rôle de senseur calcique de la sécrétion d'insuline.En conclusion, ce travail a permis de caractériser plus précisément la distribution des isoformes des Syt dans les cellules insulino-sécrétoires. Grâce aux anticorps spécifiques et au travail de localisation nous avons ouvert la voie des études fonctionnelles de cette famille de protéines qui semble impliquée dans toutes les étapes du transport vésiculaire.BORDEAUX1-BU Sciences-Talence (335222101) / SudocSudocFranceF

Distinct roles of the C2A and the C2B domain of the vesicular Ca2+ sensor synaptotagmin 9 in endocrine β-cells

Synaptotagmins form a family of calcium-sensor proteins implicated in exocytosis, and these vesicular transmembrane proteins are endowed with two cytosolic calcium-binding C2 domains, C2A and C2B. Whereas the isoforms syt1 and syt2 have been studied in detail, less is known about syt9, the calcium sensor involved in endocrine secretion such as insulin release from large dense core vesicles in pancreatic β-cells. Using cell-based assays to closely mimic physiological conditions, we observed SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein-attachment protein receptor)-independent translocation of syt9C2AB to the plasma membrane at calcium levels corresponding to endocrine exocytosis, followed by internalization to endosomes. The use of point mutants and truncations revealed that initial translocation required only the C2A domain, whereas the C2B domain ensured partial pre-binding of syt9C2AB to the membrane and post-stimulatory localization to endosomes. In contrast with the known properties of neuronal and neuroendocrine syt1 or syt2, the C2B domain of syt9 did not undergo calcium-dependent membrane binding despite a high degree of structural homology as observed through molecular modelling. The present study demonstrates distinct intracellular properties of syt9 with different roles for each C2 domain in endocrine cells