Predição in silico de potenciais off-targets para variante p.Trp402* do gene IDUA usando o sistema de edição CRISPR/Cas9

Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência da enzima alfa-Liduronidase (EC. 3.2.1.76) codificada pelo gene IDUA. A deficiência enzimática leva ao acúmulo de heparan e dermatan sulfato dentro de lisossomo desencadeando efeitos multissistêmicos. CRISPR/Cas9 é um mecanismo do sistema imune de procariotos que promove a clivagem de uma região específica a partir de um RNA guia (sgRNA) com 20 nucleotídeos. Terapia gênica com o sistema CRISPR/Cas9 vem sendo desenvolvida para o tratamento de MPS I, contudo a análise dos efeitos off-targets deve ser realizada antes da sua aplicação em âmbito clínico. O objetivo desse estudo é avaliar potenciais off-targets para a variante mais comum encontrada em pacientes com Mucopolissacaridose I (p.Trp402*). Utilizou-se cinco preditores in silico: CHOPCHOP, COSMID, Cas OFFinder, CCTop and CRISPOR. Assim, 109 sequências foram obtidas como potenciais regiões de clivagem no genoma humano, além do sítio-alvo. Ainda, a avaliação da frequência alélica de variantes nessas sequências mostrou 34 sítios polimórficos. Portanto, essas análises permitem uma avaliação antecipada do possível efeito de off-targets na funcionalidade celular durante o uso do sistema de edição CRISPR/Cas9.Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by alpha-L-iduronidase deficiency (EC. 3.2.1.76), which is coded by IDUA gene. The enzyme deficiency leads to accumulation of heparan and dermatan sulfate (GAGs) into lysosomes triggering a multisystemic disease. CRISPR/Cas9 is a prokaryote’s immune mechanism that promotes the cleavage of specific regions guided by a 20 nucleotide RNA. Therapy with CRISPR/Cas9 has been developed to treat MPS I, however a detailed investigation of off-targets effects must be performed before it reaches clinical application. The aim of this study is to evaluate possible off-target regions for the most predominant variant found in MPS I patients (p.Trp402*). In silico predictors CHOPCHOP, COSMID, Cas OFFinder, CCTop and CRISPOR were used. A total of 109 off-targets was obtained for this variant. The evaluation of allele frequency in these sequences showed 34 polymorphic sites. This analysis provides an early screening of the off-target effects in cell function before CRISPR/Cas9 system can be clinically used