evaluatiom the effect Salmonella Enteritids inoculation in the embryonated eggs and day old turkeys

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carla_Yoko.pdf: 407649 bytes, checksum: 0233373b055e117aa382c307194d5d0e (MD5) Previous issue date: 2008-08-28This study was divided into two experiments, referring to incubation and early phase. The incubation experiment had as principal aims evaluated incubation yield, the capacity to penetrate through the eggshell and the ability to colonize the gastrointestinal tract. Four hundred fertilized turkey eggs for BUT9 strain were distributed in four treatments: CCS and CCM (inoculation of placebo in eggshell and air cell, respectively); ICS and ICM (inoculation with 4,2 X 104 UFC/mL of Salmonella enterica subspecies enterica sorovar Enteritidis in eggshell and air cell, respectively). Incubation parameters calculated were: fertility, total hatchability, hatchability of fertile eggs and poult yield. Salmonella was examined in eggshell, inner and outer membranes, albumen/yolk, embryo and, after hatched, in meconium in all poult. Qualitative results were analyzed by qui-square test. It was verified that the agent maintained feasible in eggshell during the hole incubation and migrated to egg components. Incubation parameters were not affected by the pathogen inoculated in eggshell. It was also observed that Salmonella Enteritidis inoculated in air cell determined early embryo mortality, while the control treatment influenced the mortality periods in relation with CCS. The intestinal colonization of Salmonella occurred in poults derived from eggshell experimental inoculation. In the second experiment, 135 poults derived from inoculation through eggshell and drinking water were evaluated by the effects of Salmonella Enteritidis to colonize the gastrointestinal tract, determine systemic infection, hurt the intestinal integrity and change the performance variables. At 10, 20 and 28 days, turkeys and feed were weighted to constitute calculation of performance variables. After weighage, five turkeys from each treatment were necropsied to obtain datas of weight and bacterial isolation of intestine, liver, spleen and heart. Qui-square test was employed to qualitative variables and the Anova procedure to quantitative variables and average compared by Tukey test (5%). The intestinal colonization increase significantly during early phase in treatment inoculate through eggshell, but none in treatment inoculated in drinking water. The intestine showed maximum development at 10 days and higher weight at first, 10th and 28th when Salmonella was present. The digestive and absorptive capacity was impaired in infected birds. Salmonella was capable of colonized gastrointestinal tract and established systemic infection. Mortality rate was high during first week of age, with less clinical signs or anatomopathological lesionsO presente estudo foi dividido em dois experimentos, referentes ao período de incubação e fase inicial. O estudo de incubação teve como objetivo avaliar o rendimento de incubação, a capacidade de penetração de Salmonella Enteritidis através da casca do ovo e a habilidade de colonização do trato gastrintestinal. Foram incubados 400 ovos embrionados de perus da linhagem BUT9, distribuídos em quatro tratamentos: CCS e CCM (inoculação com placebo na casca e na câmara de ar, respectivamente); ICS e ICM (inoculação com 4,2 X 104 UFC/mL de Salmonella enterica subespécie enterica sorovar Enteritidis na casca e na câmara de ar, respectivamente). Os parâmetros de incubação calculados foram: fertilidade, eclodibilidade total e de ovos férteis, rendimento de peruzinhos. Salmonella foi pesquisada na casca, membrana, albume/gema, embrião e ao nascimento no mecônio de todas as aves. As respostas qualitativas foram analisadas pelo teste do qui-quadrado (2). Constatou-se que o agente manteve-se viável na casca durante todo o período de incubação e migrou para o interior dos ovos nos tratamentos inoculados. Os parâmetros de incubação não foram afetados quando o patógeno foi inoculado na casca. Constatou-se também que a Salmonella Enteritidis inoculada na câmara de ar determinou mortalidade embrionária precoce, enquanto o tratamento controle (CCM) influenciou os períodos de mortalidade em relação ao CCS. A colonização intestinal pelo patógeno ocorreu em peruzinhos oriundos da inoculação experimental na casca. No segundo experimento, 135 perus de corte de um dia oriundos de inoculação via casca e via água de bebida foram avaliados quanto aos efeitos de Salmonella Enteritidis de colonizar o trato gastrintestinal, determinar infecção sistêmica, lesionar a integridade intestinal e alterar as variáveis de desempenho. Aos 10, 20 e 28 dias, as aves e a ração foram pesadas para constituir o cálculo das variáveis de desempenho. Após a pesagem, cinco aves de cada tratamento foram necropsiadas para obter os dados de peso e isolamento bacteriano do intestino, fígado, baço e coração. Foi empregado o teste do qui-quadrado para as variáveis qualitativas e o procedimento Anova Geral para as quantitativas, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey (5%). A colonização intestinal aumentou significativamente no tratamento inoculado na casca, mas não no tratamento inoculado na água de bebida. O intestino apresentou máximo desenvolvimento aos 10 dias e maior peso ao primeiro, décimo e 28º dias quando Salmonella esteve presente. Salmonella foi capaz de colonizar o trato gastrintestinal e estabelecer infecção sistêmica. A taxa de mortalidade esteve alta durante a primeira semana de idade, com discretos sinais clínicos ou lesões anatomopatológica

Prospecção e caracterização de antígenos miméticos de aflatoxina obtidos por phage display com validação do potencial imunogênico

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Larissa Magalhães AlvarengaCoorientadores: Prof. Dr. Luiz Felipe Caron, Prof.ª Dr.ª Juliana Ferreira de MouraTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia. Defesa : Curitiba, 11/12/2017Inclui referências: p.112-122Área de concentração: PatologiaResumo: A aflatoxina é um metabólito fúngico que compromete a saúde pública e a produção animal, causando doença hepática severa, neoplasias e perdas econômicas. Por ser um hapteno, é incapaz de induzir resposta imune efetiva e produção de anticorpos anti-aflatoxina, exceto se conjugada a proteínas carreadoras. Buscando a substituição desses conjugados de toxinas como imunógenos, esse trabalho prospectou antígenos que mimetizam a aflatoxina, por meio da técnica de phage display. Nessa técnica, um anticorpo pode ser empregado como molécula alvo para a biosseleção in vitro, visando à obtenção de peptídeos que se ligam especificamente à região variável do anticorpo e que mimetizam o antígeno nativo. Dessa forma, bacteriófagos que se ligam in vitro ao anticorpo anti-aflatoxina podem ser selecionados para a obtenção de versões sintéticas de vacinas capazes de induzir resposta imune contra a aflatoxina. Assim, os objetivos do presente trabalho foram selecionar clones de fagos altamente reativos miméticos de aflatoxina B1, buscando o desenvolvimento de imunógenos capazes de induzir a produção de anticorpos anti-aflatoxina. As adequações da técnica de phage display previamente estabelecida permitiram a prospecção dos clones miméticos de aflatoxina 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23 e 3P30 que foram ligantes de anticorpo comercial monoclonal anti-AFB1. Os resultados dos imunoensaios executados indicaram a alta especificidade de peptídeos expressos por esses fagos em mimetizar in vitro as características imunológicas correspondentes à AFB1 em anticorpo específico anti-AFB1. Desta forma, foi observado que a reatividade do fago com o anticorpo foi dependente das concentrações de fago estabelecidas, assim como não houve reatividade frente a moléculas irrelevantes. Fagos expressando mimotopos de baixa reatividade (como o fago 3P25 e o fago silvestre) não foram capazes de estabelecer esta condição, indicando que os mimotopos selecionados corresponderam complementarmente ao sítio de ligação ao antígeno em anticorpo anti-AFB1. A partir da sequência aminoacídica obtida dos mimotopos selecionados, QTDLDYLHPLINSWN, o peptídeo mimético de aflatoxina foi sintetizado e conjugado à molécula carreadora para validação do potencial imunogênico. O resultado das estratégias de imunização com mimotopos e peptídeo sintético indicou que os imunógenos foram eficientes na indução de anticorpo anti-peptídeo que também foi capaz de reconhecer o antígeno original. Portanto, o mimetismo molecular do peptídeo selecionado por phage display foi confirmado, permitindo o emprego do fago como imunógeno para o desenvolvimento de uma vacina de subunidades, por meio do encapsulamento em nanopartículas de quitosana. As nanopartículas de quitosana-bacteriófago proporcionaram melhoria na resposta imune específica e local quando comparada a fagos não recobertos. Portanto, o biopolímero permitiu a administração intranasal do imunógeno e o reconhecimento do antígeno pelo sistema imune de mucosa, configurando uma plataforma eficiente na indução de anticorpos específicos anti-aflatoxina. A proposta desse modelo vacinal para o controle de micotoxinas constitui uma nova linha de pesquisa na medicina veterinária e uma alternativa para o desenvolvimento da produção animal. Posteriormente, esta abordagem racional poderá ser aplicada a outras micotoxinas que afetam as populações humana e animal. Palavras-chave: AFB1. Aflatoxicose. Peptídeo. Mimotopo. Imunógeno. Vacinação.Abstract: Aflatoxin is a fungal metabolite that compromises public health and animal production, causing severe liver disease, cancer and economic losses. Because it is a hapten, it is incapable of inducing effective immune response and production of anti-aflatoxin antibodies, unless conjugated to carrier proteins. Seeking the replacement of these conjugates of toxins as immunogens, this work prospected for antigens that mimic aflatoxin, using the phage display technique. In this technique, an antibody can be employed as a target molecule for in vitro bioselection, in order to obtain peptides that bind specifically to the variable region of the antibody and mimic the native antigen. Thus, bacteriophages that bind in vitro to the anti-aflatoxin antibody can be selected to obtain synthetic versions of vaccines capable of inducing an immune response against aflatoxin. Thus, the objectives of the present work were to select highly reactive mimetic phages of aflatoxin B1, seeking the development of immunogens capable of inducing the production of anti-aflatoxin antibodies. The adequacy of the previously established phage display technique allowed the prospection of aflatoxin 3P8, 3P13, 3P16, 3P20, 3P23, and 3P30 mimetic clones that were binder of commercial anti-AFB1 monoclonal antibody. The results of the immunoassays performed indicated the high specificity of peptides expressed by these phages in mimicking in vitro the immunological characteristics corresponding to AFB1 in specific anti-AFB1 antibody. Thus, it was observed that the reactivity of the phage against the antibody was dependent on the established phage concentrations, just as there was no reactivity to irrelevant molecules. Phages expressing low reactivity mimotopes (such as 3P25 phage and wild-type phage) were unable to establish this condition, indicating that the selected mimotopes corresponded complementary to the antigen-binding site in anti-AFB1 antibody. From the amino acid sequence obtained from the selected mimotopes, QTDLDYLHPLINSWN, the aflatoxin mimetic peptide was synthesized and conjugated to the carrier molecule to validate the immunogenic potential. The results of mimotope and synthetic peptide immunization strategies indicated that the immunogens were efficient in inducing anti-peptide antibody that was also able to recognize the original antigen. Therefore, the molecular mimicry of the peptide selected by phage display was confirmed, allowing the use of the phage as an immunogen for the development of a subunit vaccine, through the encapsulation in chitosan nanoparticles. Chitosan-bacteriophage nanoparticles provided improved local and specific immune response when compared to uncoated phages. Therefore, the biopolymer allowed the intranasal administration of the immunogen and the recognition of the antigen by the mucosal immune system, configuring an efficient platform in the induction of specific anti-aflatoxin antibodies. The proposal of this vaccine model for the control of mycotoxins constitutes a new line of research in veterinary medicine and an alternative for the development of animal production. Subsequently, this rational approach could be applied to other mycotoxins that affect human and animal populations. Keywords: AFB1. Aflatoxicosis. Peptide. Mimotope. Immunogen. Vaccination

Efeitos da Salmonella Enteritidis experimentalmente inoculada na saúde gastrintestinal de perus Effects of experimentally inoculated Salmonella Enteritidis on the gastrointestinal health of turkeys

Avaliaram-se os efeitos de Salmonella Enteritidis sobre a colonização e o desenvolvimento do trato intestinal, a conversão alimentar e o ganho de peso em perus. Um total de 135 perus de corte de 1 dia foi distribuído em três tratamentos: controle; perus oriundos de ovos inoculados com Salmonella Enteritidis via casca e perus desafiados com água de bebida com Salmonella Enteritidis. Aos 10, 20 e 28 dias, avaliaram-se as variáveis de desempenho e coletaram-se amostras para avaliação bacteriana, biometria e histomorfometria. Realizaram-se também, nos dias 1, 15 e 28 de idade, coletas de mecônio/excretas de todas as aves. A colonização intestinal aumentou durante a fase inicial quando Salmonella foi inoculada via casca. O intestino apresentou maior peso ao 1º, 10º e 28º dias quando Salmonella esteve presente, sem diferença no comprimento. Salmonella Enteritidis foi capaz de colonizar o trato intestinal, estabelecer infecção, reduzir o desempenho das aves e modificar as estruturas celulares do intestino. A contaminação da casca do ovo antes da incubação propiciou a ocorrência de infecções ao nascimento, e a frequência de isolamento de Salmonella Enteritidis persistiu até 28 dias de idade. A inoculação de Salmonella pela água de bebida gerou aves infectadas, porém com menor nível de infecção com o avançar da idade. O desempenho de aves inoculadas com Salmonella Enteritidis é menor e isso confirma potenciais prejuízos para a produção avícola.<br>The effects of Salmonella Enteritidis on the colonization and development of the intestinal tract, feed conversion and weight gain were evaluated. A total of 135 day old turkeys were assigned to three treatments: control; turkeys from eggs inoculated with Salmonella Enteritidis via shell and turkeys challenged with drinking water with Salmonella Enteritidis. At 10, 20 and 28 days, the performance variables were evaluated and samples were collected to perform bacterial assessment, biometrics and histomorphometry. On days one, 15 and 28, samples of meconium/excreta were collected from all birds. The intestinal colonization increased during the initial phase when Salmonella was inoculated via eggshell. The intestine showed greater weight on the first, tenth and 28th days when Salmonella was present, with no differences regarding the intestine length. Salmonella Enteritidis was able to colonize the intestinal tract, establish infection, reduce bird performance and modify the cellular structures of the intestine. Contamination of the eggshell before hatching generated birds susceptible to infection at birth and the frequency of isolation of Salmonella Enteritidis persisted until 28 days of age. Salmonella inoculation by drinking water generated infected birds, but with less recovery of the pathogen with age increase. Inoculated birds showed inferior performance, confirming the potential damage to poultry production